转基因蛋白量值溯源传递关键技术的研究.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 C37转基因蛋白量值溯源传递关键技术研究 赵东戴荣继1邓玉林2宰 北京理工大学生命学院，北京100081 本研究针对的是当前研究较热的转基因作物，转基因植物在提高作物产量，改善作物品质， 减少农药使用量等方面发挥着重要的作用。但是随着转基因作物的大面积种植，转基因植物 本身的安全性及其对人类健康和生态环境的潜在威胁已成为国际社会和广大民众普遍关注的 热点问题之一。而转基因蛋白是转基因植物安全性评价的主要指标之一。目前作为生物大分 子的蛋白质在检测计量方面存在诸多问题，如定值方法，量值溯源体系和量值传递体系等都 存在争议，在国际上也是一个新的研究热点。我国在转基因植物蛋白的检测方面缺乏权威计 量方法和计量标准，难以保证检测结果的可溯源性，同时也缺少准确灵敏的检测方法和标准 物质，难以保证蛋白质量值的可靠传递。转基因植物蛋白计量标准和量值溯源传递体系的建 立不仅可以保证检测结果的溯源传递以及国际等效一致性，而且对我国转基因植物的安全性 评价及相关法律法规的制定具有重要的科学价值和现实指导意义。 该方法首先选取了三种常见的基因片段杀虫蛋白Bt，抗除草剂蛋白CP4．EPSPS和豇豆胰 蛋白酶抑制剂作为研究对象。本研究主要针对Bt蛋白，通过基因工程技术，将目的基因片段 连接六个组氨酸后导入工程菌，进行发酵。得到的粗蛋白通过镍金属螯合亲和层析，等电聚 焦等方法得到纯化。 然后进行定量，主要有两种方法，一种为酶联免疫法，通过酶联免疫法进行标准曲线的 绘制，在这里结合文献对酶联免疫法进行了多种条件的摸索优化，从而选取最佳的条件，其 抗浓度为1：500，二抗浓度为1：500(图1)。 另一种方法是通过液质联用进行定量分析的方法学建立。液质联用之前，通过参考文献 min，2min，5 对酶解的条件进行了优化摸索，分别采用了70。Ci／H热O．5 rain，10min和用含有 通讯地址：北京市海淀区中关村南大街5号．Email：dairongji@bit．edu．en 2通讯联系入：邓玉林，男，教授．Email：deng@bit．edu．cll 132 全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 DTT的交性剂的混合液进行变性，然后通过100raMIAA进 7M，4M，2M，IM尿素和lOmM 行烷基化，用胰蛋白酶酶解21h，固相萃取。冻干，离心。运用ESI-TOF和常用的液质联用条 件对转基因植物蛋白的序列进行测定，具体包括：(1)氨基酸丢失，修饰和变异的检测：对 蛋白标准物的分子量进行测定，与理论分子量进行比较，以确定氨基酸丢失，修饰和变异情 况；(2)一级序列测定：根据理论酶切肽段的质量大小和带电荷数选取母离子，调节碰撞能 量和碰撞气体的大小，使肽段尽可能从肽键处断裂。由MassSeq软件完成各肽段氨基酸序列 的推导。 Bi／Bo 52t…n-一r—-*…——一”。·——……—n-。…—”-—一……一一-一-一V-…一一-～…一… 二抗1：500 线性(二抗1：500} 8．79 8．08 7．38 6．67 5．95 5．24 lgA 图l一抗浓度为l：500，二抗浓度为1：500时测得的标准曲线图 经过以上一系列的工作，从而得到转基因蛋白的标准定值方式。 References and Innovation 【1】ZhangYmg(张英)．ScienceTechnologyHerald(科技创新导报)．2008，32，228 f2】2 Zhao J Qi8n(赵芊)WangHo