新耐药基因HA117的发现和耐药功能研究.pdfVIP

新耐药基因HAll7的发现及耐药功能研究 重庆医科大学附属儿童医院金先庆 retinoic 背景：全反式维甲酸(A11．fransacid，ATRA)是我国学者首先研究并广 泛应用于临床的一种恶性肿瘤诱导分化剂，及化疗辅助用药。ATRA的临床应用 是否会引起耐药至今仍在争论之中。近年来，越来越多的临床研究提示，ATRA 与化疗药物联合应用或单独使用时，肿瘤细胞对ATRA的敏感性降低。ATRA耐 药现象是偶然发生还是自然规律，发生耐药的机制是什么，这些都是研究人员和 临床专家关注的焦点。8年来，本研究采用少量、递增、多次、反复ATRA处理 肿瘤细胞株，建立了HL一60／ATRA耐药株，在此基础上，先后采用抑制消减杂交、 基因芯片技术、同源性分析等技术获得HAl17基因主要片段DNA序列。采用瑞 17全长序列。一系列耐药实验证明HAll7是一个新的与耐药相 氏方法获得HAl 关的基因。 目的： 用实验方法证明ATRA临床应用可产生耐药性，寻找ATRA耐药相关基因，阐 明其耐药机制。 方法： 1．建立HL．60耐药肿瘤细胞株HL．60／ATRA。 2．采用抑制消减杂交技术、基因芯片技术、序列同源性分析技术，对HL．60与 17。 HL一60／ATRA细胞株进行对比研究，确定一个与ATRA相关的耐药基因HAl 3．采用“Silicon cloning技术，进一步获取HAll7基因全长序列，1110bp。 4．将克隆的HAl17基因转染K562细胞株，并检测、确认转染成功。 5．采用MTT法证明HAl17高表达可引起K562细胞株的耐药。 6．采用短片基因干扰技术，抑制HAll7的表达，进一步验证HAll7高表达具有 重要作用。 结果： 胞在较高浓度(10．7M)的ATRA中仍保持原有的细胞增殖周期及分化状态不变。 同时药物敏感性实验证实HL．60／ATRA对多种化疗药物：VCR、ADM、MMC、 VP．16、DNR、CTX等均产生了不同程度的耐受，耐药倍数为3．10倍不等。 2．采用抑制消减杂交(SSH)建立了HL．60／ATRA抑制消减杂交文库。在进行SSH HL．60／ATRA中差异表达的基因。将经过两次消减杂交及PCR扩增后的产物经 “A．T clone’’克隆到pUC57／T载体，进而转染大肠杆菌获得消减文库，共挑选出 510个克隆，经PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200．700bp的克隆有 433个，阳性率高达84．8％。 3．用基因芯片技术对抑制消减杂交文库进行筛选，将消减文库中通过PCR的方 法所鉴定出的的433个阳性克隆的产物经过纯化后用于制备基因芯片。经过筛选 挑选出ratio值大于3的克隆112个。在这l12个克隆中我们挑选了12个在HL．60／ ATRA呈高强度差异表达的基因克隆进行序列测定。 4．序列同源性分析结果：在进行测序的12个克隆中，11个为已知基因片段，1 个为未知基因片段。其中一已知基因片段与热休克蛋白90 B)高度同 13(Hsp90 源。 5．采用“silicon cloning”的方法，进一步获取未知基因全长序列，获得一条含有 完整编码框、长度为1991bp的基因序列，该基因命名为HAll7。新基因定位于 14号染色体上，并编码一由365个氨基酸组成的碱性蛋白，该蛋白含有4个与 蛋白激酶磷酸化有关的功能位点，其功能结构域与新近发现的参与调控细胞凋亡 的重要基序…“PYRlN同源。 ll 6．HA7转染不对宿主机体细胞产生损害。 7．肿瘤细胞耐药敏感性实验结果提示，HAl17高表达可引起对化疗药物耐受， P0．05。 8．采用RNA干扰技术封闭HAll7后，HAll7表达受到抑制，对化疗药物的抑制 作用消失，P0．05。 47 结论及意义： 1．ATRA作为化疗辅助药物，临床应用可以引起肿瘤细胞对ATRA的耐受。 2．引起对ATRA耐受的主要原因是：一定浓度的ATRA可引起肿瘤细胞内HAll7 基因的高表达，HAl