烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养.pdfVIP

中国烟草学报 ActaTabacariaSinica http：／y／cxb．tobacco．org．cn doi：10．16472~．chinatobacco．2014．408 89 烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养 刘晓璐 ，杨柳青 ，吕乐 ，郭涛2，刘永智 ，赵鹏 ，董昕 ，闫海 1北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083； 2山东省农业科学院水稻研究所 ，济南 250100 摘 要：对四川广元烟草主产区三个种植基地的烟草根际固氮菌进行筛选，分离出28株具有固氮活性的菌株。经扩增rDNA限 制性酶切片段分析法 (ARDRA)初步分类，共获得5个操作分类单元 (OTU)，并由16SrDNA序列进行了分析鉴定。结果表明不 同分类单元分别是：苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和炭疽杆菌。优化了N7菌株 (巨大 芽孢杆菌)培养条件，确定其最佳碳源为蔗糖，最适宜初始pH值为7．5，最适温度为30~C。 关键词：烟草；固氮菌；筛选；16srDNA；优化培养 引用本文：刘晓璐，杨柳青，吕乐，等．烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养 [J]．中国烟草学报，2015,21(1) 氮是烤烟生长过程 中最重要的营养元素之一，其 供理论依据 。 供应量的高低对烤烟生长 以及产量质量具有重要的影 1 材料与方法 响 [1]。在烤烟吸收的氮营养中，60％以上来 自于土壤， 肥料氮仅 占总氮量的35％左右 [2。】，因此，提高土壤 1．1 土壤和菌种 供氮量对烤烟获得高产具有重要的实践意义。为提高 土壤样品取 自四川省广元市的烟草种植区，取样 土壤供氮能力，部分学者提出了采用生物固氮菌来提 地点为植烟时间 1O年 以上，且烟草质量、产量都较 高烤烟的固氮和供氮能力，并且取得 了一定的研究成 高的种植区。将取得的土壤样本在生理盐水中稀释后 果。卢江平 和阎启富 5【于 1996年进行了生物固氮 涂布到Ashby无氮培养基平板上，25~C恒温培养 7d。 菌在烤烟上的应用效果试验，结果表明，生物 固氮菌 取长势 良好的单克隆菌落，在Ashby培养基上划线培 的应用可 以显著提高烤烟产量和产值，特别是不施用 养 2d，用接种针取菌划线转接到牛肉膏蛋 白胨培养 氮肥处理，烤烟栽培经济效益提高显著高于施用氮肥 基上培养，获得固氮菌纯化菌株，保存于 一2O℃。 处理，证明生物固氮菌对促进烤烟生长具有 良好的作 1．2 培养基 用；王豹祥研究了不同菌种对烤烟养分吸收以产量质 Ashby培 养 基：KH2PO40．2g，CaCO35g， 量的影响规律，结果表 明，固氮菌处理烤烟产量提高 MgS0i7H200．20g，甘露醇 10g，NaC10．2g，琼脂 18g， 9．12％，产值提高 30％ 以上，而化肥使用量降低 了 CaS042H，O0．1g，蒸馏水 1000mL。 26％；罗红燕 【研究证 明，vA菌根可 以显著促进烤 牛肉膏蛋白胨培养基 ：牛肉膏5g，蛋白胨 1g， 烟生长，氮磷钾养分利用率可以提高 10％以上，植 NaC15g，琼脂 18g，蒸馏水 1000mL。 株干物质积累量提高20％以上，土壤 内微生物数量 1．3 16SrDNA鉴定 提高幅度达到 163．2％，土壤 内有效氮磷钾提高 12％ 生工 SK8255提取全基因组试剂盒提取筛选的固 以上，对提高烤烟经济效益具有重要的作用。烤烟固 氮菌全基 因组 DNA。NANODR0P2000 (Thermo)检 氮菌的施用导致烤烟产量升高的主要原因是固氮微生 测DNA的质量和浓度并将DNA工作浓度调至 100． 物可以较好的为烤烟提供氮素营养，促进烤烟对氮元 200ng／