乳糖诱导重组甲基对硫磷水解基因在大肠杆菌中表达.pdfVIP

第三届“农药与环境安全”国际学术研讨会暨 第七届“植物化学保护和全球法规一体化”国际研讨会论文集 SⅢ一002(Ⅲ一026) 乳糖诱导重组甲基对硫磷水解 基因在大肠杆菌中的表达 杨继建1‘2 乔传令1 1中国科学院动物研究所 2中国科学院研究生院 摘 要对硫磷农药经过对硫磷水解酶作用后，其毒性下降100～120倍，表明人们可以利用 有机磷水解酶来防止有机磷农药的中毒及消除有机磷农药的污染。通常，使用IPTG诱导DE3 (BI。21)表达外源基因；但因其价格昂贵且有毒，乳糖代替1PTG作为Lac启动子的诱导剂成为自 然选择．特别是大规模生产中。本文研究了乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌 表达重组有机磷水解酶(OPH)，研究分析比较了诱导的起始阶段、所需的乳糖浓度、诱导持续时间 和诱导温度等参数对重组产物表达量的影响以及对甲基对硫磷的降解活性。结果表明，乳糖能够 作为诱导剂诱导外源蛋白的合成。乳糖诱导外源蛋白的表达量约占菌体总蛋白的27．1％，达到 IPTG的诱导水平(30．5％)的90％，低温能够增加可溶性目的蛋白的表达，对甲基对硫磷的降解活 性达到7190U。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组甲基对硫磷水解酶工业化生产提供了一 定的参考，并最终消除环境中的农药污染打下了基础。 关键词乳糖，低温诱导，甲基对硫磷水解酶，大肠杆菌 有机磷水解酶(organophosphoms 解有机磷的酯酶[1]。这种酯酶可以水解包括有机磷神经毒化学战剂和一些广泛使用的杀虫 hydrolase， MPH)是有机磷水解酶成员之一，能催化各种有机磷化合物的水解，尤其对甲基对硫磷农药作 用更明显，是公认的处理有机磷化合物最有前途的酶之一L2J。 实验室小规模样品制备时，IPTG是常用的诱导剂。但在大规模发酵生产重组蛋白时，其 毒性和昂贵的价格限制了它的应用。乳糖是一种二糖，无毒性且价格低廉，可以作为诱导剂启 TGl)，发酵液中目的蛋白的 诱导表达PIP(Ribosome—InactivatingProtein，pMS质粒，E．coli 最终含量(21．4mg／L)达到IPTG诱导下表达水平(38．7 终达到12 mmol／I．IPTG诱导的效果。 mg／L以上，超过了1 本实验对重组工程菌株E．coli 进行了优化。分别考察了诱导时机、诱导剂量和诱导方式三个因素的不同水平对蛋白表达的 影响。为5I．发酵罐放大培养提供参考，为乳糖代替IPTG作为诱导剂的研究提供了依据。 Yw—G-008)。 基本项目：中国科学院知识创新工程项目(NO．KSCX2 91。 通讯作者：乔传令，电话：86—10—648071 50 Ⅲ 农药毒理与环境安全评估 Ⅱ 实验材料 1．1菌种和质粒 含pET30a—mpd重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)由本实验室构建并冻存。 1．2 培养基 10。 种子培养基为LB培养基(g／L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 2 实验方法 2．1 种子培养 2．1．1种子培养 mL 从平板中挑取单菌落于5 EB培养基中37℃培养过夜。 2．1．2摇瓶发酵 mL