突变K—ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响.pdfVIP

维普资讯 维普资讯 · 482· 中国肿瘤临床 2007年第34卷第9期 肺癌的发生 、发展以及侵袭 、转移是多基因参 连接酶将二者连接 ，然后转染大肠杆菌DH5ot。挑选 与、多步骤发生的过程 。K—ras基因是一类在肺癌 的 阳性克隆。少量快速提取质粒 。双酶切鉴定转移质粒 发生发展中起非常重要作用的癌基因ll，2]。大量研究 pAdTrack-H1／siK-ras 。 证实 。1／3左右 的非小细胞肺癌 中存在 K—ras基 因 1．2．2．2 重组腺病毒质粒载体 的构建及鉴定 取 点突变。且主要在腺癌中表达 。K—ras基 因点突变 1IxgpAdTrack—H1／siK—rasⅥ 质粒 。Pme酶切线性化 与不 良预后密切相关_4]，是肿瘤基 因治疗 的潜在靶 后与 0．1Ixg的质粒 pAd／PL混匀 ，加至感受态菌 点之一。RNA干扰 (RNAi)是近年来应用广泛 的基 BJ5183，用 CaC1法转化细菌。经氨苄抗性培养基筛 因阻断技术 ，在基因组功能研究、肿瘤基因治疗等方 选 ．挑取 阳性克隆小量提取质粒，根据琼脂糖 电泳显 面具有广阔的应用前景 。本研究利用同源重组腺病 示质粒大小，初步筛选重组体 ，再进一步经 XholI 毒制备方法 。构建 了表达人 12密码子点突变的K— 酶切、序列鉴定，提取重组腺病毒质粒 pAd／PL—HI／ ras基 因 siRNA重组腺病毒 ，于人肺腺癌细胞系 siK—rasⅥ备用 H441中观察 siRNA腺病毒对 内源性突变 K—ras基 1．2．2．3 重组腺病毒 的包装 、扩增和纯化 pAd／ 因表达的影响。为肺癌 的基 因治疗提供重要的理论 PL—H1／siK—rasv惶质粒 DNA经 Pac酶切线性化后 ， 基础 。 经脂质体 LipofectamineMT2000介导转染 293细胞 ， 1 材料与方法 进行重组腺病毒 AdH1／siK—rasⅥ 的包装 。转染 7～ 1．1 材料 10天 出现细胞病变 ，表现为贴壁细胞变圆、核浓缩 、 人肺腺癌细胞株 H441(突变型 K—ras基 因， 脱落 ，出现病毒空斑 ，收集细胞 ，于一80℃及 37℃反 12codonGGT突变为GTY)购 自美 国ATCC公司；质 复冻融4次裂解细胞 。离心后收集含病毒的上清，重 粒 pSilencer3．1(Ambion公司)；质体转染试剂 Lipo— 新感染 293细胞进行病毒的大量扩增 。重组腺病毒 fectamineMT2000(Invitrogen公司)；质粒提取试剂盒 AdH1／siK—rasⅥ大量扩增后经 CsC1密度梯度超离 (Qiagen公司)；K—ras、13一actin抗体 (武汉博士德生 心法纯化 ，一80℃保存备用。 物工程有限公司)；pAdTrack、pAd／PL由北京京师利 1．2．2．4 病毒滴度测定 利用酶标仪检测 OD抛吸 源技术有限公司提供 ；腺病毒包装细胞 293细胞购 光值，进行病毒效价的测定；采用生物法进行病毒滴 于中国科学院上海细胞生物所 。T4DNA连接酶 、限 度的测定。 制性 内切酶 EcoRI、Hindm