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与细胞衰老和癌变 周俊宜 中山医科大学生化教研室 主要内容 端粒的结构与功能 端粒酶的结构与功能 端粒、端粒酶与细胞衰老 端粒、端粒酶与恶性肿瘤 1）早期的原始复制模型 2）端粒酶模型 3）重组模型 6 端粒的复制模型 酵母细胞 酵母细胞 酵母TS 四膜虫TS Shampay的加尾实验 1 端粒酶的发现 Blackburn的实验 加热或蛋白酶 孵育 四GT 酵GT pBR322 四CA 孵育 四膜虫抽提物 5’ 3’ 1）端粒的加尾方向是按GT链从5’端 3’端。 2）每次加一个重复单位。 3）似为无模板复制。 4）被加尾的末端序列具有特异性。 5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性的物质。 实验推论： 2 端粒酶的结构 1987年，Blackburn 柱层析 RNP结构 四膜虫端粒酶RNP 含有RNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对RNA酶极为敏感。 RNA组分 Protein CAACCCCAA CAACCCCAA 端粒酶RNA 1）CAACCCCAA结构，有碱基修饰。 2）反义RNA封闭，能抑制酶活性。 反义RNA 3）Greider的点突变实验： 点突变 端粒酶RNA序列 C A 端粒 端粒酶 A A C T T G C G C A T C A A 端粒酶蛋白质 1995年，Collins K等首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分： p80 p95 遗传密码 碱基互补 人类端粒酶蛋白质 ？ 同源序列 核酸探针 重组DNA分子 TTGGGGTTGGGGTTGGGG 5’ 5’ TTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCC 3’ 5‘ oH3’ 5’ CCAACCCC 3’ 5’ TTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCC 2.聚合 1. 结合 3.移位 爬行模式 3 端粒酶的功能 TTGGGG TTGGGG CCAACCCC 末端补齐机制： 5‘ GGGGTT （GGGGTT）n 端粒酶 5’ G-G配对回折 3‘ 5’ DNA聚合酶 4 端粒酶活性的测定 1994年，Kim首创端粒重复扩增法（TRAP）。 TRAP的电泳检测 梯形条带 加样孔 TS引物 CX引物 细胞提取物 端粒重复序列 PCR扩增产物 * * 周俊宜 基础医学院生化教研室 AGAACTT TCTTGAA TCTTGAA AGAACTT 子代DNA 碱基互补 按半保留复制的方式，子代保留了亲代 DNA 的全部遗传信息。 亲代 DNA AGAACTT TCTTGAA DNA 决定蛋白质的功能 将基因信息代代相传 复制 转录和翻译 生命活动的执行者 生命延续的物质基础 5’ 5’ 端粒消耗 端粒维持 细胞衰老 细胞永生化 染色体DNA 端粒 端粒 七十年代：端粒分子组成确定 八十年代：端粒酶的发现 九十年代：端粒酶与细胞衰老和癌症 三十年代：端粒概念首次提出 研究概况 “端粒和端粒酶的研究历程就象不断伸缩的端粒本身变幻无穷，并且不时带给人们某些惊讶。从三十年代端粒概念首次提出，一直到今天活跃在恶性细胞中的端粒酶研究热潮的兴起，人们眼中的端粒和端粒酶已不仅仅限于它们所形成的染色体的‘保护帽’，它还显现出更加意味深长的内涵…… ” “人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中获得“永生”。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的“天敌”，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。 近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老研究的一条全新纽带，国际权威期刊Cell、Science等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。” 二十世纪三十年代，两位著名的遗传学家Barbava McClintock和Hermann J.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。于是Muller从希腊文的末端（telos）和部分（meros）