猪繁殖和呼吸综合征病毒HBKM2株ORF5基因的克隆和原核表达.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 猪繁殖与呼吸综合征病毒邶K抛株oRF5基因的克隆与原核表达 梁望旺伍锐杨克礼刘泽文熊忠良段正赢邓均华徐涤平‘ (湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉4300“) 达，表达的融合蛋白GsT-nsGP5分子量约为43KDa，并具有反应活性．本研究为进一步研究PRRSVGP5蛋白的功 能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础。 关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRsV)；囊膜蛋白(GP5)；克隆；原核表达 猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcille州)rodu嘶”锄d 科的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRsV)引起的一种高发病率和死亡率的传染病，自1987年在 美国首次报道，现已遍及世界各地，严重危害着世界养猪业。我国自2006年以来，由PRRsV变异株 引起的“猪高致病性蓝耳病”，更是给我国养猪业造成了巨大的经济损失…。迄今为止，PRRSV可分 (EU．type)，两者的核苷酸同源性仅60％左右弘J。 疫和体液免疫【3，4】，该基因在体外进行高效表达不仅有利于深入研究该蛋白的结构与功能，而且有望 开发新型疫苗(亚单位疫苗)和诊断试剂。 1材料与方法 1．1质粒、毒株与菌种 分离自2008年湖北某场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪组织。 1．2试剂 DNA聚合酶购自日本东洋纺1’oYOBO 病毒RNA提取试剂盒购自大连宝生物公司；KOD—plus 公司；RT试剂盒、限制性内切酶、T4 上公布的PRRSV P5S：5’．GGTGGGCAACYGTrllAGCCTGTC．3’ P5R：5’一GGTAATRGAAAACGCCAAAAGCACC．3’ Pns5S：5’-CCGQ△△I]匮CTGTGCTCGTCAACGCC．3’(E幻尺I) I) 1．3病毒基因组的提取与ORF5全基因扩增 DNA聚合酶和 按试剂盒操作说明进行病毒RNA的提取和反转录，利用高保真度的KoD—plus 35个循环后，68℃10min。将PCR回收产物送至上海生工测序。 1．4序列分析 X 利用DNAStaf软件包和clustal1．83对PRRsvHBKM2株的O刚巧全基因序列进行分析，并 与GenbaIll【中挑选的参考毒株进行序列比对，并利用MEGA4．0软件，卜iJ法构建系统发育进化树 (boots仕印值为1000循环)。 作者简介：梁望旺(1979一)，男，河南光山人，硕士，助理研究员，(电话电子信箱) 通讯作者，徐涤平． 1wwl979929@yall00．com．cn； 335 猪的传染病一猪繁殖与呼吸综合征 1．5无信号肽的oRF5基因的扩增 DNA聚合酶和引物PIls5S， 以1．3步骤扩增的包含oRF5全基冈的片段为模板，利用KoD—plus 60℃30sec，68℃1 rnin，35个循环后，68℃lOⅡlin。 1．6 t组表达质粒pKG．璐5的构建 将PCR产物ns0RF5用DNA凝胶回收试剂盒回收，用髓棵I和ⅪlDf1分别对nsORF5和 筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定和序列测定(由上海生工公司完成)。 1．7重组质粒pKG．ns5的原核表达与检测 r／min摇床培养至对数生长期(OD600 有氨苄青霉素(终浓度为100“幽nL)的LB培养基中，37℃、220 =0．6～1．0)时，加入1PTG(终浓度为1．0mmo垤。)诱导表达3小时后，收集菌体按文献【5l所述的 抗为HRP