半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测.pdfVIP

中国水产科学 2015年 1月，22(1)：1-8 JournalofFisherySciencesofChina 研 究论 文 DoI：1O．3724／SP．J．1118．2015．00057 半滑舌鳎 vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测 黄进强 ，2一，陈松林2，邵长伟2，刘洋4，林帆2，李亚亚2，王娜2 1．中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003； 2．中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东 青岛266071； 3．甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 4．大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023 摘要：为研究半滑舌鳎 (Cynoglossussemilaevis)vasa(Csvasa)基因调控 区的功能，在已克隆的Csvasa基因编码序列 的基础上，采用基因组步移和 PCR扩增的方法克隆得到 Csvasa调控区，通过生物信息学方法分析 vasa基因5区， 并构建了含 Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体 (pCsvasa—GFP—T)，进一步通过显微注射技术初步验 证调控区的驱动活性。结果表明，通过基因组步移和 PCR扩增获得 Csvasa5’区5166bp和3’区 1655bp，利用在 线生物信息学软件对 5区序列进行分析，发现在转录起始点上游 26bp处存在保守的TATA框，以及潜在的转录因 子结合点如 SRY、Oct．1、Sox．5、CREB、GATA、AP．1、C／EBP、Sp．1、c．Myc、HNF、NKX2．5、V-Myb等。通 过显微注射技术，将所构建的 pCsvasa．GFP—T表达载体注射于青鲻(Oryziaslatipes)受精卵并进行培养观测，发现 Csvasa调控区能够驱动 GFP在青 胚胎内表达，荧光表达率为 81％。将有荧光的胚胎培养为成鱼，检测外源基因 的整合率为 11．5％。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记 、追踪和操作研究以及半滑舌鳎 的性别控制等奠定了基础。 关键词：半滑舌鳎；vasa启动子；显微注射；绿色荧光蛋 白；转基因；驱动活性 中图分类号：$917 文献标志码：A 文章编号：1005—8737一(2015)01—0001—08 启动子是位于结构基因 5端上游的 DNA 序 移、分化的途径以及配子的发生过程。Olsen等2【 列，通过与转录因子的结合而控制基因表达的起 和Yoon等3【]早在 1997年就利用 vasa基因作为分 始时间和表达程度。启动子作为转录水平的重要 子标记物鉴定斑马鱼(Daniorerio)的PGCs，其后 调控元件，是转基因研究的一个关键内容。vasa 研究人员开始利用vasa基因调控区驱动绿色荧光 基因是最先在果蝇(Drosophilamelanogaster)中发 蛋 白(GFP)基因表达产物作为标记，更直观地追 现的母源性基因，它编码依赖 ATP的RNA解旋 踪 PGCs。Yoshizaki等[4l利用虹鳟(D cD．izyc矗s 酶，是 DEAD．Box家族中的一员…。此后，这一基 mykiss)vasa调控区驱动 GFP在 PGCs中表达，并 因在许多其他物种中相继被发现，并且在多数物 成功建立了PGCs特异表达GFP的转基因虹鳟品 种的生殖细胞系中特异表达 ，为生殖细胞的形成 系。随后，研究人员对青鲻(Oryziaslatipes)[5J和斑 和配子的发生所必需。因此，vasa基因作为一种分 马鱼(Daniorerio)J的 vasa调控区也开展了类似 子标记基因被广泛应用于生殖细胞和原始生殖细 研究。林帆等[7-81采用PCR方法扩增vasa基因调 胞(PGCs)的信号跟踪，从而揭示 PGCs产生 、迁 控区，连接入去除巨细胞病毒 (CMV)启动子 的 收稿 日期：2014．02．15；修订 日期：2014—04．07 基金项 目：国家 自然科学基金项 目项 目31072202)；国家 863计划项 目(2O12AAO922O3)；山东省泰山学者工程专项 作者简介：黄进强(1980一)，男，博士，主要从事鱼