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止血生物效价用于白及品质评价的研究 　　[摘要]采用凝血酶时间（TT）将对照物质维生素K1注射液与白及参照物质进行对比检定，对白及参照物质进行标化，建立了白及体外测定凝血酶时间的生物活性测定方法，运用“量反应平行线法”（3.3）对不同产地的白及进行止血生物效价测定。白及参照物质量效之间具有良好的线性关系（Y=66.332-23.913X，R2=0.995 3），测得不同产地白及止血生物效价为821.93～1 187.53 U?g-1，并均能通过可靠性检验（偏离直线P0.05，偏离平行P0.05）。该方法仪器精密度（RSD 3.8%）、中间精密度（RSD 4.6%）、重复性（RSD 3.2%）、稳定性（RSD 3.7%）较好，所建立的白及止血生物效价检测方法可靠，操作简便，重复性好，可用于白及止血生物效价的测定。 　　[关键词]白及；凝血酶时间；止血生物效价；质量控制 　　白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb. F.为兰科植物白及的干燥块茎，性温，味苦、甘、辛，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮的功能[1-2]。白及作为一种传统的中药，被民间广泛使用。2010年版《中国药典》所收载的白及质量控制标准中仅有显微鉴别、薄层色谱鉴别、水分检查、总灰分等，很难全面的对白及的质量进行评价。 　　近几年，将生物检定法用于中药质量控制已成为研究的热点[3]。生物检定法从整体的角度出发，能量化生物效应，反映中药在临床应用中的量效关系，特别适用于药效物质基础不清楚而药效明确的药物。本实验建立了基于凝血酶时间测定的白及生物活性测定法，为完善其现行的质量控制标准，以及其临床用药的安全性、有效性提供保障。 　　1 材料 　　白及样品13批（贵州3批，正安燕岩2批，正安桴焉、四川、云南楚雄、甘肃、安徽、广西河池、江西樟树、关岭县花红镇各1批），经贵阳医学院生药学教研室龙庆德教授鉴定均为兰科植物白及B. striata （Thunb.） Reichb. F. 的干燥块茎。参照文献[3]，10批生物检定用白及参照物质来源于白及B. striata （Thunb.） Reichb. F ，产地贵州正安县，等级优级。 　　凝血酶时间（TT）测定试剂盒（TT试剂为2 mL/瓶，批号STY20301-39，北京世帝科学仪器公司）；水合氯醛（AR，批天津市科密欧化学试剂有限公司）；阳性对照药：维生素K1注射液（批号1307126431，辰欣药业股份有限公司）。 　　LG-PABER-I血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；Allegra64R台式冷冻离心机（美国贝克曼公司）；LT5001E电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）。 　　健康SD大鼠，体重280～320 g，雄性，由贵阳医学院动物实验中心提供，使用许可证号SCXK（黔） 2012-001。 　　2 方法 　　2.1 凝血酶时间（TT）的测定 　　2.1.1 供试品溶液的制备 取不同产地白及分别以8倍、6倍、6倍量水煎煮，每次1 h，合并滤液，浓缩（药材质量与药液体积比为1∶5），加95%乙醇至含醇量为70%，搅匀，放置过夜，过滤，滤渣挥去乙醇，真空减压干燥（60 ℃），粉碎成粉（平均得率14.6%），混匀，保存于干燥阴凉处。取适量粉末，用蒸馏水溶解，配制成生药浓度60 g?L-1的溶液，临用时按1∶0.8倍剂距等比稀释成一定浓度的供试品溶液。白及参照物质按上述方法制成工作对照品溶液。 　　2.1.2 大鼠血浆的制备 取SD大鼠，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，用一次性专用真空采血管（含3.8%枸橼酸钠）1∶9抗凝，4 ℃ 3 000 r?min-1离心15 min，吸取上清液，制备待测血浆。 　　2.1.3 TT的测定 取一次性血凝仪测试杯，每通道加入血浆100 μL，和相应的样品溶液50 μL，磁珠搅拌混匀，准确预温180 s，加入TT试剂100 μL，用LG-PABER-I血小板聚集凝血因子分析仪测定每个通道的凝血酶时间。 　　2.2 白及参照物质原始效价赋值与标定 　　以维生素K1为对照物质对白及参照物质（记为Bjs05）的止血生物效价进行标化（Bjs05是10批自制白及参照物质的等比混合物）。并且将Bjs05的止血生物效价定义为1 000 U?g-1。 　　2.3 不同批次白及参照物质的止血生物效价变异考察 　　测定自制的10批白及参照物质止血生物效价波动情况，测定方法同2.1.3。 　　2.4 白及止血生物效价测定方法 　　将所配置的白及参照物质Bjs05和样品溶液按1∶0.8剂间距稀释，以白及参照物质Bjs05为工作对照组（S），不同产地白及样品溶