快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用.docVIP

快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用 　　[摘要]建立简单快速的金银花真伪分子鉴别方法。该研究依据金银花trnL-trnF 625位G/T SNP位点设计快速位点特异性PCR引物，优化位点特异性PCR条件，对金银花及其9种混淆品进行扩增及检测。当在87 ℃预变性1 min；87 ℃变性5 s，68 ℃延伸5 s，30个循环时，通过加入SYBR Green I染料染色，金银花样品显绿色荧光，混淆品无荧光。整个PCR反应可在30 min内完成。该研究结果说明快速位点特异性PCR能简单快速鉴别金银花及其混淆品。 　　[关键词]快速PCR；金银花；分子鉴定；荧光检测 　　自Millus等1985年发明PCR技术以来，PCR已成为分子生物学研究中的最基本和普遍手段之一。由于PCR的重要性，为了提高实验效率、节约成本，对该技术的改良从未停止过。早在1991年，Yap等[1]通过更改PCR条件以缩短PCR反应时间。而Wittwer等[2-3]通过使用毛细管进行PCR反应，即利用热空气注入法快速控温，从而减少升降温的时间，使得30个PCR循环可以在30 min内完成[4]。在此基础上，提出了快速PCR（rapid PCR）的概念。 　　准确、快速是中药分子鉴别的核心需要。目前已报道的中药分子鉴别方法，如RAPD，SSR，SCAR，PCR-RFLP，AS-PCR，AFLP及DNA条形码等均依赖于PCR技术[5-6]。快速PCR与其相结合，将缩短PCR反应时间、提高效率，有利于中药分子鉴别技术的现场运用和推广。 　　本文基于已建立的金银花位点特异性PCR真伪鉴别方法[7]，对PCR的反应程序进行了优化，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，结合药材DNA快速提取技术[8]，可将金银花真伪分子鉴别时间控制在30 min左右，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。 　　1 材料 　　1.1 药材 选取来自于不同产地的8个忍冬正品及9种16个忍冬属伪品材料进行快速位点特异性PCR研究。植物样品采自广西、河南、山东、北京、安徽地区，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和广西药用植物园，见表1。 　　1.2 仪器 GeneAmp 9700型PCR扩增仪（Applied Biosystem公司）；5810 R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries 公司）；DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；HE99X-15-1.5型电泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）；ZF-7A型手持式紫外灯（上海谷村电子光学仪器厂）。 　　1.3 试剂 琼脂糖购自Promega公司；溴化乙啶购自Fluka公司；rTaq DNA聚合酶、Ex Taq聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、2 000 bp DNA Marker购自TaKaRa公司；AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix购自Roche有限公司、Transfast Taq DNA聚合酶购自Transgen有限公司；10 000×SYBR购自Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　2 方法 　　2.1 快速位点特异性PCR引物设计 此前，本课题组已验证金银花trnL-trnF序列625位G/T变异可以准确鉴别金银花及其同属伪品[7]，本文据此位点设计快速PCR鉴别引物。通过Premier Primer 5.0（http：///primerdesign/）设计快速位点特异性PCR引物，调整参数使上游引物为3′末端与625位G/T的SNP位点互补，Tm值为65～70 ℃，在引物3′末端倒数第二位引入人为错 　　确定快速位点特异性PCR反应条件。20 μL PCR反应体系包含2 μL 10× rTaq buffer，1 μL 10 mmol?L-1 dNTPs，0.25 μL 10 μmol?L-1上游及下游引物，0.5 U 快速Taq酶，1 μL 20% PVP 40溶液，0.5 μL 10 g?L-1 BSA溶液，1 μL（约10 ng）DNA模板。PCR反应在9700型PCR扩增仪上进行。由于Yap等报道94 ℃预变性1 min即可实现全基因组解链[1]，而本课题组前期证实94 ℃预变性1 min可实现PCR产物的有效扩增，依此设定初始反应程序见表2，在此基础上开展PCR反应条件的优化。 　　反应结束后在PCR反应体系内加入2 μL 100× SYBR Green I（Invitrogen公司），混匀后于365 nm紫外波长肉眼下检测荧光。另取PCR反应产物，加入5 μL 6× Loading buffer （Ta