β-葡萄糖苷酶基因过量表达提高Trichoderma+reesei降解纤维素底物的活性.pdfVIP

第二届中围资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集 2007．07．15．18威海 B一葡萄糖苷酶基因过量表达提高Triehodermareesei降解 纤维素底物的活性 赵雪娜汪天虹。 山东大学微生物技术国家重点实验室，济南，250100 摘要：丝状真菌作为低等真核生物具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点，同时， 又具有真核基因表达和真核蛋白质翻译后修饰加工装置，因此近年来丝状真菌分子生物 学逐渐成为现代分子生祝膨f-研究的一个热点。瑞氏木霉(Trichodermareesei)是自然 界中广泛分布的腐生?丝乡扶真菌，具有完整的纤维素酶系和半纤维素酶系，用Zreesei 作为工业菌株生产玎∥7才：嗣值物材料的酶类，已有多年历史。 Zreesoi纤维索酶系包括3种酶，-它们协同作用将纤维素降解成寡糖和葡萄糖。 其中纤维二糖毋。解酶硼内切葡聚糖酶协同作用降解纤维素生成寡糖，主要是纤维二糖， 而B一葡萄糖暂酶继续将纤维二糖降解成葡萄糖。过量纤维二糖的存在对纤维二糖水解 酶和内切葡聚糖酶会产生反馈抑制作用，从而降低整个纤维素酶系降解纤维素底物的效 率。B一葡萄糖苷酶能够降解纤维二糖，从而可以解除这种反馈抑制。Zreesei中B一 葡萄糖苷酶的分泌量很低，因而成为整个纤维素酶系有效降解纤维素底物生成葡萄糖的 瓶颈。因此，提高B～葡萄糖苷酶的表达是增强Zroesof降解天然纤维素底物能力的 一条重要途经。 本文从Z 成功转入坛JJ基因的转化子。对这6株转化子摇瓶发酵并进行酶活测定，筛选得到一 株B一葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活都有较大提高的转化子2—6，其6一葡萄糖苷酶酶活和 染色体上纠』基因拷贝数增加，证明转入的bgll基因整合到Zreesei染色体上。结 果表明由于转入的纠，基因整合到Zreesei染色体上提高了BGLI的表达量，从而提 高了Zreesei整个纤维素酶系降解天然纤维素底物的能力。本研究进一步证实对丝状 真菌工业生产菌株进行遗传操作是菌株改造的一条行之有效的途径。 为了解BGLI在Z reesei细胞内的分泌机制，本文将绿色荧光蛋白gfP基因作为 报告基因与叫』基因融合，把得到的融合片段插入载体pTHP，再将重组质粒转入pyr6 基因缺陷的Z 初步验证得到7株gfp基因稳定遗传的转化子。将这些转化子接种到以乳糖为碳源的诱 导培养基中诱导bg]l／g—p融合基因的表达。经过酶活测定筛选得到一株转化子卜17， 分析结果表明转化子卜17染色体上的纠』基因拷贝数增加，证明转入的喇，基因整 合到Z 的蛋白条带，推测为BGLI／GFP融合蛋白。对转化子进行荧光观测未检测到荧光，分析可 能是因为以与BGLI融合蛋白形式存在的GFP不能形成正确的结构，因此不能发出荧光， 或者由于所发出的荧光较弱而被菌体自发荧光掩盖，因此难以检测。 将bgll基因3’端加上编码六个组氨酸标签的序列并克隆到载体pTHP中，再将得到 第二届中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集 2007．07．15-18威海 卧青霉(Penicillium 筛选转化子，共得到约40株转化子，通过PCR初步验证得到3株bgll基因稳定遗传的 转化子。测定转化子的B一葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活，初步得到1株B一葡萄糖苷酶 和滤纸酶活均提高约20％的转化子，为进一步的研究奠定了基础。 关键词：瑞氏木霉；BGLI；纤维二糖反馈抑制：bg]l基因过量表达；绿色荧光蛋白；融 合蛋白；斜卧青霉