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结核病患者和正常人血清蛋白质 双向凝胶电泳差异比较 广州市胸科医院510095刘志辉刘玉美罗强生 尹小毛谭守勇 刘健雄李昕洁 中山大学附属肿瘤医院510080云径平 鉴于血清学诊断的简便、快速以及其在许多传染病诊断中所发挥的重要诊断作用，血清学诊 断始终是结核病免疫学关注的焦点。但由于体液免疫与结核病发生、发展与转归的相关性仍不明 晰，目前针对结核分枝杆菌各种抗原的抗体检测临床价值受限。我们必须另辟溪径寻找结核病血 清学诊断标志物，蛋白质组学技术为此提供了研究的平台。本研究采用双向凝胶电泳技术(two． dimensional polyacrylamide gel 组进行研究，以期筛选出结核病相关血清蛋白，现报道如下。 1对象与方法 1．1研究对象 1．1．1 核患者10例(以下简称“．组”)及肺外结核患者(包括结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、骨关节结 诊断，并均在化疗前抽取血清样本。另外选取性别、年龄匹配的10名健康人群作为对照(以下简 称“正常组”)。 1．5m1分装于3支冻存管中，．80℃保存。 1．2方法 1．2．12-DE样品的制备将每个血清样本12000r／min离一1二,5min，取上清液，应用Ettan Sample PreationKitsand Reagents(Amersham 每个样本的蛋白浓度。然后依每个样本的浓度取合适体积的血清将每组的血清样本混合，以保证 每个混合样本的蛋白量大致相同。将混合样本在冰上混匀，12000r／min离,l二,5min，测定混合样本 组：65．3ug／ul。 4—7IPG胶条进行等电聚焦，且水化和聚焦同时进 1．2．2双向凝胶电泳本实验采用17cm pH Amersham 行，第一向电泳在IPGphor等电聚焦仪(美国，GE Ettan Amersham DaltII垂直电泳垂直电泳仪(美国，GE 冲液(pH 轻轻地撕开胶条保护膜，然后胶面朝下轻轻将其放于样品混合液上(注意不要引入气泡)。(3) 在胶条上轻轻加入约2mlIPG胶条覆盖油，盖盖后放入IPG 线性，30min(除盐)；1000V 速，60000V 307 I％DTT和2．5％碘乙酰胺的平衡液中各轻轻振摇10min。(5)将平衡好的IPG胶条轻轻转移至12％ 十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺(SDS．PAGE)分离胶上，进行第二向电泳。电泳条件为：：恒功 率：2W／胶条1h；17W／胶条6h。 1．2．32-DE凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法，具体操作参见文献。 1．2．4差异蛋白质分析用Umax 2D 的图像文件。再将tiff格式文件导入ImageMasterPlatium5．0软件系统进行分析，主要包括图像 加工．、蛋白质斑点检测与定量、凝胶匹配、数据分析等过程。 2结果 23个清晰可见的蛋白质点。正常组与+组、一组、肺外组的匹配率分别为74％±2％、76％±2％和 常组中表达上调，+1～+9在+组中表达上调(见图1)；．组与正常组间有18个差异蛋白质点，其 组、一组、肺外组合并为结核组与正常组比较有分子量(KD)／等电点分别为30／6．1(在图l、2、3中 为C8、C5、C1l点)3个差异蛋白质点，其中前2个蛋白质在结核组中表达上调。正常组与+组、一 组、肺外组间2．DE电泳图谱比较分别见图1--3。 讨论 结核分枝杆菌作为结核病的主要病原菌，其全基因组序列测定已于1998年完成，标志着人 类对结核病的认识进入了后基因组时代，蛋白质组学热浪的掀起拉开了后基因组时代的序幕。目 前，人们对结核分枝杆菌本身的蛋白质组已有所研究，