大肠杆菌O157溶源性Stx噬菌体的you导及鉴定.pdfVIP

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集465 大肠杆菌0157溶源性Stx噬菌体的诱导及鉴定 夏炉明“，严亚贤1，刘佩红2，王建2 (1．上海交通大学农业与生物学院，上海201101；2．上海市畜牧兽医站，上海201103) 摘要：本研究采用PCR方法对62株大肠杆菌菌株进行Stx基因检测，将筛选到的溶源菌进行噬菌体的 诱导、分离和纯化，利用自行制备的Stx2溶源性I,tCl061作为指示菌筛选Stxl噬菌体，并对相关基因进行 了测序鉴定，研究发现选择作为实验材料的这8株0157溶薄茁存在优先释放Stx2噬菌体。不释放Stxl噬 57． 菌体的现象。本研究有助于从一个全新的角度来诊断、监剥和预防大肠杆菌01 关键词：Stx噬苗体，诱导，剥序，鉴定 新发现的和重新抬头的病原微生物，是当今世界医学界面临的一个新课题。大肠杆菌0157已被 列为一种新的人兽共患病病原，可引起婴儿的腹泻、出血性结肠炎(HC)、继发溶血性尿毒综合征 噬菌体的通过溶源转换将stx基因整合到宿主菌的染色体上，使宿主菌获得产生相应毒素的能力。因此 从大肠杆菌中分离Stx噬菌体并对其进行有关的研究将为揭示0157的致病机理、分子流行特征等有着 重要意义。同时为0157的预防、免疫和检测打下基础。 1材料和方法 1．1 材料 和上海交通大学农生院兽医生物技术研究所保存。 均购自北京天为时代科技有限公司；大肠杆菌D157诊断血清购自兰州生物制品研究所；pMDl8一T 载体购自大连宝生生物工程有限公司；丝裂霉素c购自阿敏生物公司。 1．2方法 列，利用Primer5．0软件设计两对引物，两对引物序列如表一1所示。引物由上海生工生物工程有限公 司合成。 表格1引物序列 !!塑墨塑 !l塑壁型 芏塑笪堕量鏖!塑! 堡丝塑壁!!! StxlPl 5一ACAGACTⅣ兀TrCATCAGGAGG．3554 58 StxlP2 5一AATCAGGCAGGACACTAC．3 S衄2Pl 5一TTCTTCGGTATcCTN兀℃C一3789 58 St】【2P2 5一TGACTCTCTrCA兀℃ACGGCG一3 1．2．2筛选菌株：62株待检菌接种LB液体培养基过夜培养，取1¨l作为模板，应用以上两对引物筛 的大肠杆菌0157菌株作为试验材料保存备用。 、 ‘基金项目：国家自然科学基金(编号 严亚贤为联系作者．021y趾yaxi衄@町tILedu．cn 466 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 ‘ 录试验结果。 - 即为噬菌体滤液．于4。C保存。 1．2．4噬斑的观察川：以MCl061作为指示菌，利用双层琼脂平板法[21观察噬菌体的噬斑形态，将噬菌 观察噬斑特征。 1．2．5制备抗大肠杆菌素抗性的MCl061： 左右，按1．2．4制备噬斑的步骤与噬菌体滤液浇注双层琼脂平板并置于温箱中培养10h，从双层琼脂平 板上挑单个白色菌落接种LB液体培养基振荡培养16h，将这种具有大肠杆菌素抗性但是不能产生噬菌 斑。 1．2．6噬菌体的分离纯化(参照分子克隆)121。 1．2．7噬菌体基因的检测 1．2．7．1噬菌体DNA的提取(参照分子克隆)日l。． 1．2．7．2噬菌体的基因检测 菌体DNA。PCR反应体系和反应参数参照1．2．2。 个菌落接种LB液体培养基振荡至混浊。以Stx2引物采用PCR方法检测是否溶源成功，将溶源成功 筛选Stxl噬菌体，同时以Anti—MCl061作为对照。 1．2．9噬菌体滤液中噬菌体种类的基因检测：将步骤1．2．3中保存的噬菌体滤液取500斗1按照1．2．7．1 体的种类。 1．210 亚单位，对其进行割胶回收、连载体、转化感受态细胞、PCR鉴定并取lmL菌液送上海生工生物工程 有限公司进行测序，测序结果进行Blast分析。 2结果 2．1筛