β-甘露聚糖酶的基因工程技术研究.pdfVIP

论文集l p一甘露聚糖酶的基因工程技术研究i 13一甘露聚糖酶的基因工程技术研究 丁宏标乔宇陈小兵 (中国农业科学院饲料研究所，北京100081) D一甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究的热点之一，也是近十年来在美国应用最 EC3．2．1．78)是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解p— 甘露聚糖酶(D-mannanase l，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露 聚糖及§一甘露聚糖等。p一甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线 2004，2005)。甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量 最高的一类半纤维素，而且在许多植物中有如淀粉样的大量积累(Chesson，1987；李欣 等；1980)。畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶，对这类物质的转化需要添加外源酶。 饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足，消除和降解饲料原料中的抗营养因子，促 进畜禽生长，减少养殖污染。甘露聚糖类物质用酶处理，也可生产高品质的甘露寡糖产品。 1．D一甘露聚糖酶研究的历史和菌种选育 早在本世纪初就有关于分解植物甘露聚糖的报道，但直到七十年代，D一甘露聚糖酶 的研究才逐渐深入起来。尤其是近十多年来对半纤维素资源的开发和甘露寡糖益生价值的 发现，以及p一甘露聚糖酶诸多用途的发现，大大推动了D一甘露聚糖酶研究的发展。 糖酶的概念和定义，为以后的研究打下基础。七十年代后，大量p一甘露聚糖酶的产生菌 株被筛选、诱变，研究培养基成分特别是碳源对酶产生的影响，进行多糖结构的分析。同 时，许多不同来源的D一甘露聚糖酶被分离纯化，对酶的基本性质的研究取得了较大发展。 国内自80年代开展微生物甘露聚糖酶发酵生产技术研究，进展很快。1980年我国李 欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。1985年以后，随着p一甘露聚糖酶和甘露寡糖应 用领域的开发，新菌种筛选和诱导育种等相关研究竞争显著加剧。如杨文博等(1995)研 究了产D一甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件。崔福绵等(1999)研究了 2006 1 蓄杏蓉宴尊参黩术交易大会 枯草芽孢杆菌中性p一甘露聚糖酶的产生及性质，选育菌种的酶产量达到120U／111l。我国 另一具有特色的工作是分泌p一甘露聚糖酶的分离选育。如中国科学院微生物研究所马延 和等(1991)较早提出利用极端微生物菌种分泌的碱性p～甘露聚糖酶生产甘露寡糖的方 法。利用嗜碱芽孢杆菌N16—5以魔芋粉为原料，发酵生产D一甘露聚糖酶，发酵液的酶活 力达到500U／ml，甘露寡糖后提取收率80％以上。 丁宏标等从1995年开始饲用酶菌种筛选工作，分离得到一株能分泌酸性D一甘露聚糖 酶的黑曲霉。其分泌的p一甘露聚糖酶，工作温度30～85℃，最适反应温度70。C，反应 pH2～9．2，最适pH3．0～5．8；摇瓶条件下酶活力达到150U／ml，符合饲料用酶条件。 该菌种、发酵工艺、及甘露寡糖和酶的应用方法已申请中国发明专利。 2，p一甘露聚糖酶的工业生产和基因工程的研究进展 国内外对D一甘露聚糖酶、甘露寡糖生产方法的研究涉及酶的生产、纯化与特性研究、 基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。生产技术方面的标志性进展有： 1987年日本理化研究所对芽孢杆菌AM一001的D一甘露聚糖酶，通过多种方法选育，酶活 酶，其菌种Bacilluslentus的产酶能力达400U／ml，随后开发用做饲料添加剂，是目前美 国销量最大的饲料用酶(美国专利5)。 13一甘露聚糖酶基因工程方面的研究已有成功报道。有一些p一甘露聚糖酶被克隆， subtilisNM-39的p一 并在大肠杆菌中表达，，如Mendoza等(1995)将克隆自Bacillus 甘露聚糖酶基因转入大肠杆菌DH5a表达，重组酶活力为4．9U／m。还有其它微生物来源 Bacillus sp．)AM-001、极端嗜热厌氧菌、荧光 的基因，如嗜碱芽孢杆菌