K562%2fVP16细胞系中肿瘤干细胞样细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究.pdfVIP

·50· K562／VP，6细胞系中肿瘤干细胞样细胞对 伊马替尼耐药机制的初步研究 宋永平房佰俊 河南省肿瘤医院、河南省血液病研究所(郑州，450008) 【摘要】 目的进一步阐明一些高表达P-糖蛋白(P一印)的慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼耐药的 利用干细胞高效能将Hoechst -：5群细胞，即边缘细胞(side SP细胞，并初步探讨了其抗伊马替尼的机制。 population，SP)，称为K562／VPl6 SP细胞及非K562／VPl6SP细胞(Non—SPK562／VPl6)中的表 结果Bcr／Abl和Abl蛋白在K562细胞、K562／VPl6 SP及Non—SPK562／VPl6细胞中均高表达 达水平差异无统计学意义；P-gp在K562细胞中不表达，在K562／VPl6 且表达水平一致；与Non—SP 白血病细胞产生对伊马替尼临床耐药的重要机制；自血病细胞对伊马替尼具有一定的抗性，可能与数量极少的 白血病干细胞有直接的关系。因此，这类数量极少的于细胞样的肿瘤细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞。 【关键词】伊马替尼；K562；肿瘤干细胞；多药；抗药性 国内外的临床研究发现，部分CML患者可在短期内对伊马替尼发生耐药，大部分服用用伊马替尼的CML患者 在疾病的加速期和急变期都会对伊马替尼产生耐药。最近的研究已经提示，这种耐药现象的发生可能是Bcr／Abl 药形成有关翻。然而，越来越多的证据提示，CML起源于白血病肿瘤干细胞，伊马替尼对其分化出的相对成熟的 子代白血病细胞具有明显的生长抑制作用，但对CML白血病干细胞，伊马替尼可能是部分、甚至是完全耐药 的l孓-51。 33342染色的特异性及干细胞提纯方法，运用流式细胞术，建立 最近，Setoguchi等同利用干细胞对Hoechst 了一种从多种肿瘤细胞系中分选肿瘤干细胞样细胞的方法。在本实验中，我们首先建立了一株耐药的慢粒细胞 抗伊马替尼的机制进行了初步探讨。 1材料与方法 1．1材料 33342染料及碘化丙锭均为美国 菌素A(CsA)、戊脉安(verapami)噻唑蓝(MTr)、二甲亚砜(DMSO)、Hoechst sig- nailing公司产品，抗人P-gp单抗为美国Santa 司)产品。 1．2细胞培养、药物诱导与分选 VPl6终浓度为8斗mmoUL的培养液维持传代，实验前脱离VP。。培养48h(耐受VP埔的倍数不变)。用流式术从 SP细胞及non—SPK562／VPl6细胞。 1．3 Real—time PCR检测多药耐药基因的表达 细胞总RNA的提取、cDNA的合成及real—timePCR的操作依据文献【7]进行。 1．4免疫印迹 mmol／L mmol／L SDS，1 DTr) 取适量细胞，用PBS洗涤两遍，以200斗L裂解液(50 8．0，5g／L Tris—HCI，pH mmol／L钒酸钠，1 裂解，离心收集上清。用RIPA缓冲液(含有2mmogLEDTA，50mmol／L氟化钠，0．1ps／ml亮 膜经彻底洗涤后，用过氧化物酶标记的抗兔或山羊IsG进行二抗标记。使用ECL增强化学发光系统检测反应蛋 白与Crkl或B—actin的比值