综述%3a应用DGGE分析口腔样本中菌群情况.pdfVIP

综述：应用DGGE分析口腔样本中菌群情况 张昕首都医科大学附属北京口腔医院(100050) 最近大量应用非培养的技术进行对细菌的分离，这是因为通过现有的研究，我们还缺乏对大多 数细菌自然生态条件的了解，并且很难准确复原与自然生态条件相仿的培养基。DGGE(变性梯度 凝胶电泳)就是一种用于研究细菌的非培养的分子生物学方法，用以检测复杂生态条件下细菌多样 性。通过DGGE方法，能够将PCR产物中相同片断长度但碱基序列不同的DNA片断分离。这种分 离方法的原理是因为部分解链的双链DNA分子在聚丙烯酸凝胶中迁移的能力不同，部分解链的分子 在电泳液中迁移的距离小于完全未解链的双链分子。又由于碱基序列不同的分子解链行为不同，因 此会在胶中的不同位置停止迁移。应用PCR—DGGE技术对牙髓病细菌学进行研究，已经发现在有症 状和无症状的牙髓炎病例中优势菌的组成结构存在明显差异，因此就可以根据细菌菌落的组成结构 来分析牙髓炎的症状。 大量科学证据证明，能在实验室培养出的微生物仅占自然界中的很少一部分。微生物很难培养 出来的原因之一就是缺乏对细菌理想生存条件的认识，而且大多数微生物只有在它们自然的生存环 境中才能旺盛生长，还有一种可能就是不同种属的细菌间需要相互依存才能更好生长。另外大多数 细菌种属在它们的自然环境中都生活在有秩序的群落中，在这个群落中相互联系的过程对群落中所 有成员的生存都起着重要作用。所以将细菌分别在固体培养基中单独培养就相当于瓦解了它们之间 的相互联系，同时也解释了一些细菌种属不能被培养的原因。 已经有明确证据证明，要对不同环境中微生物多样性做全面分析，只靠培养的手段是不够的。 随着分子生物学研究手段的发展已经能够鉴别出更多的微生物，并且使对微生物多样性的研究达到 了基因水平。微生物可以根据它们的基因相似性进行分组，同时也可以反映出它们进化过程中的关 系。利用分子生物学技术比如用于扩增细菌16SrDNA基因的PCR(聚合酶链反应)技术，以及克 隆和测序技术，大量研究已经揭示出，事实上所有环境中微生物的多样性远远多于迄今为止所期望 得到的，而且用培养的方法不足以发现的微生物的多样性。最近利用对16SrDNA序列中高变区进行 测序的非培养方法的实验已经表明，在根管样本中的大多数细菌种属还无法通过培养的方法得到， 这也说明我们目前所掌握的有关这些细菌种属的知识依然很局限。 分子生物学诊断方法与培养法相比有许多优点，除了能够被培养的微生物外，还可以直接从临 床样本中而不是人工培养的样本中发现不能被培养的微生物种属，也就是说，因为微生物核酸的发 现就不需要在实验室中培养微生物，另外分子生物学诊断方法具有很高特异性，可以根据模糊的行 为准确地鉴别微生物菌株，包括发散菌株和聚集菌株(发散菌株是指具有相同种属但不同表现行为 的一类菌株，而聚集菌株是指属于不同种属但具有相似表现行为的一类菌株)。分子生物学方法很敏 感，在较低的样本浓度下也能检测出靶基因，通常比较快速且节省时间。分子生物学方法在采样和 转移样本时不需要严格控制厌氧条件，在使用抗生素治疗时也可以使用分子生物学方法。当遇到大 量样本做流行病学研究时，可以将样本分别低温保存，然后一起评定。 究不同健康人和患者的菌丛情况。但是克隆技术通常费时、费力且费用昂贵，所以事实上不用于多 种样本分析。目前基因指纹技术已可以替代克隆技术，因为通过基因指纹技术已经能够得到某～研 究环境中细菌群落中基因多样性的全部档案资料。另外还可以通过测序的方法对菌群中的不同优势 菌进行鉴别。变性梯度凝胶电泳法(DGGE)已经成为研究菌群指纹的非常常见的技术之一。 ·57· 本文意图是从理论的角度描述DGGE方法，以及如何对不同类型牙髓感染病例中的菌群情况应 用DGGE方法进行分析做一综述。 DGGE方法 用通用引物对16SrDNA保守区进行PCR扩增，扩增产物的混合物通常是样本中来自不同细菌 种属等长的基因片断。因为大多数通常所用的电泳方法只能根据基因片断的长短不同来将其分开， 所以无法鉴别等长基因片断细菌的多样性，而DGGE就是一种能将长度相同但碱基序列不同的DNA 片断鉴别出来的一种电泳方法，鉴别的过程要通过16SrDNA扩增产物的基因片断在电泳中完成。 DGGE在聚丙烯酰胺凝胶中加入呈线性梯度增加的DNA变性剂(100％化学变性剂溶液含7M尿素 和40％qa酰胺)，将准备好的高浓度和低浓度的变性溶液