日本JFH-1株丙型肝炎病毒细胞培养体系简介.pdfVIP

固本JFH—Ii株丙型肝炎病毒细胞培养体系简介 李津 北京天坛生物制品股份有限公司 【摘要】丙型肝炎病毒(HCV)感染导致慢性肝炎。自1989年HCV发现以来，因其宿主范围仅 限于黑猩猩和入的肝组织，一直不能在常规培养细胞中复制，限制了对其复制过程、致病机理与疫苗开 发等的研究。近来日本胁田隆字博士等从一名爆发性丙型肝炎患者体内分离出一株HCV全长基因克隆， 可在不发生适应性突变情况下，在多株细胞中复制。用体外转录的全长JFH一1株HCVRNA转染Huh．7 人肝癌细胞后，其RNA能在细胞中复制，重组病毒颗粒能分泌至培养液中，且分泌的病毒颗粒对Huh．7 细胞和黑猩猩具有感染性。如在对HVC驯化易感的Huh一7衍生细胞中培养，则显示出更高的感染性。 该HCV感染细胞体系的建立是近年来HCV研究中的重大突破，是今后了解HCV完整增殖周期、研究 抗HCV治疗方法和开发丙型肝炎疫苗的强有力技术平台。 前言 自1989年确认HCV为丙型肝炎病原体以来，因其宿主范围仅限于黑猩猩和人的肝组织，一直不 能在常规培养细胞中复制，对其生活史、复制和致病机理与疫苗开发等的研究倍受挫折。BertoliniL等 用人骨髓来源的B细胞CE株1，ItoT等用慢性丙肝患者原代肝细胞“，MizutaniT等用I型白血病病毒 感染克隆的人T细胞MT-2C株“‘，IacovacciS等用人胚肝细胞“，FournierC等用正常人肝原代细胞”， Rumin S等用成人肝细胞”，ZhaoX等用原代地鼠肝细胞…等尝试过进行HCV的细胞培养试验。在这些 尝试中，HCV的复制效率低下，须用条件苛刻的逆转录聚合酶链反应(I盯～PCR)技术检测HCV的 复制。胁田隆字等设想HCV不同克隆株间的复制能力应有所差异，其与加藤孝宣等合作，从一名爆发 性丙型肝炎患者体内分离出一株HCV全长基因克隆…，以JFH一1株构建的无结构区亚基因组复制子可 在多株细胞中高效率复制，在Huh一7细胞中可产生具有感染性的HCV病毒颗粒。 JFH．1株HCV来源患者病例简况 1999年，东京都神经科学总和研究所的胁田隆字从名古屋市立大学的加藤孝宣处获得来自一例爆 发性丙型肝炎患者的血清。患者为32岁男性，入院时周身疲惫、高热、肝功能紊乱，无肝病史，无吸 毒和酗酒经历。入院前6个月未输过血，无经静脉给药情况，未进行过针灸治疗，无与己知肝炎病毒携 带者的性接触。患者谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)高，凝血酶原时间低，出现2期肝昏迷 指症。用RT--PCR检出HCV RNA，抗--HCV抗体阴性。其他病毒性肝炎指标，包括抗甲型肝炎病毒 抗--HBc和皿V—DNA)及GB病毒一CRNA均为阴性。据此该病例诊断为HCV相关爆发性肝炎。 贝／ml水平。入院65天HCV不能测出，此时抗一HCV抗体阳性。入院65天病情显著改善并出院。为 研究这例爆发性丙型肝炎本人的HCV株特异性，胁田隆字等自该病例急性期血清中分离出HCV的RNA 并克隆，命名为JFH—l株，用RT--PCR扩增后进行了全基因序3／IJN序。 JFH—l株HCV序列分析 一850．一 JFH—l株HCV全序列测序后确定为2a基因型。为进行对比研究，胁田隆字等从6例慢性丙型肝 放读码框架(ORF)。从6名慢性丙型肝炎患者分离的HCVJcH一1到6株的基因组全长分别为9681、 型的原型株)有一定的差异。在亚基因区核苷酸序列分析中，JFH—l株5’UTR区与其他株的差异最大， 异最大，平均遗传距离比分别为1．560、。1．464和1．5968。 FarciP等1996年报道过一例爆发性丙型肝炎患者体内HCV病毒株具有单一性“。胁田隆字等通过 检测JFH一1株HVR观察了患者体内HCV准种存在情况，在患者入院急性期的两个时点一第1天和第 隆中，17个HVR序列一致，其余3个仅有一个氨基酸的替换；急性晚期第23天的20个克隆中，20 个HVR序列完全一致，提示患者体内病毒克隆的单一性与爆发性丙型肝炎发病相关，且JFH一1株、 特别是其的5’UTR区、C区、NS3区和NS5A区的特征性与爆发性丙型肝炎有特异性关联。 JFH一1株核心蛋白的优势加工特点 HCV基因组C区编码的核心蛋白构成病毒颗粒的核衣壳，同时在宿主细胞中具有多种调节功能。 在病毒组装时核心蛋白历经两个连续的、与膜结构相关联的剪切修饰过程后产生p23和p2l两种形态的 蛋白。在宿主信号肽肽酶的作用下，从附着在内质网上的