ELISA试验技术要点.docVIP

酶联免疫吸附试验 （Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA） 一、基本原理： 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅，可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待测样品进行定性和定量分析，同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。 目前使用的酶联免疫检测方法很多，应用较多的有： 间接法——用于测定抗体 双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原 竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原 二、试验材料及试剂 酶标板（聚苯乙烯微量96孔板） 包被液（0.05M pH9.6 碳酸盐冲液） 无水Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水定容至1000ml 洗涤液（0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液） NaCl 8.0g KCL 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO4?12H2O 2.9g 吐温-20 0.5ml 蒸馏水加至1000 ml 封闭液 明胶 1g 包被液 100ml 抗体稀释液 明胶 0.1g 洗涤液 100ml pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液） 0.1M柠檬酸 (19.2g/L) 24.3ml 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml 蒸馏水 50ml TMB底物使用液 TMB储存液（100mg溶于10mlDMSO,40C保存） 0.1ml 底物缓冲液 10ml 30%H2O2 10ul 现用现配 终止液（2M H2SO4） H2SO4（96%） 22.2ml 蒸馏水 177.8ml 三、基本操作 间接ELISA 操作步骤如下： 包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4℃孵育过夜； 洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次； 封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 待检血清：加入适当稀释度的待测血清，0.1ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 底物：加入TMD底物使用液，0.1ml/孔； 37℃孵育15min 终止液：加入2M H2SO4，0.1ml/孔； 测定：终止后立即用酶标仪测定各孔OD 450nm。 双抗体夹心ELISA 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：℃孵育过夜； 洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次； 封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 待检样品：加入适当稀释度的待测样品，0.1ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上 底物：加入TMD底物使用液，0.1ml/孔； 37℃孵育15min 终止液：加入2M H