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【转贴】【加密0】 噬菌体的检查及效价测定噬菌体的检查及效价测定[日期：2004-12-22] 来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 1 目的 1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。 1.2 学会检查噬菌体的方法。 1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。 2 原理 ? 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 ? 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。 ? 采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。 ? 噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。 3 材料 3.1菌种 ? 敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。 3.2培养基 ? 二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。 3.3仪器和器具 ? 无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒温水浴锅，离心机、721分光光度计等。 4 流程 4.1噬菌体的检查 4.2噬菌体效价的测定 5 方法 5.1 噬菌体的检查 5.1.1 样品采集 ? 将2～3g土样或5mL水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。 5.1.2 增殖培养 ? 30振荡培养12～18h, 使噬菌体增殖。 5.1.3 离心分离 ? 将上述培养液以3000rpm离心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀释至10-2～10-3，用于噬菌体检查及效价测定。 5.1.4 生物测定法 5.1.4.1双层琼脂平板法 5.1.4.1.1 倒下层琼脂 ? 融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。 5.1.4.1.2倒上层琼脂 ? 融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。 5.1.4.1.3恒温培养 ? 30恒温培养6～12h观察结果。 5.1.4.1.4 观察结果 ? 如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑????噬菌斑。 5.1.4.2 单层琼脂平板法 ? 省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30恒温培养6～16h后观察结果。 5.1.5 离心分离加热法（快速检查） ? 取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。 5.2 噬菌体效价的测定 5.2.1 倒平板 ? 将融化后冷却到45左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。 5.2.2 稀释噬菌体 ? 按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中