孕马血清促性腺激素定量检测试剂盒的建立与应用.docVIP

孕马血清促性腺激素定量检测试剂盒的建立与应用 章金刚 军事医学科学院输血医学研究所 血清或血浆成分的检测多采用免疫学方法。根据检测的目的不同，检测方法很多，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种最为常用也比较成熟的试验技术，既可用于定性，也可用于定量。在医学和兽医学实践中，大多数的检测试剂盒都是基于ELISA方法。目前，用于检测抗原（包括孕马血清促性腺激素（PMSG）），多采用双抗体夹心ELISA。理论上讲，对于孕马血清促性腺激素（PMSG）的定量检测，应该采用双抗体夹心ELISA方法。 要建立PMSG的双抗体夹心ELISA，必须首先获得特异性好、敏感性高、亲和力强的抗体。所用抗体可以是纯化的多克隆抗体（抗血清），也可以是单克隆抗体（单特异性）。上述两类抗体各有优缺点，关键是标准化、特异性、敏感性、重复性的问题。 以下从主要研究内容、试验技术方案、基本经费预算、可能存在问题（风险因素）等几个方面简要叙述，供参考。 一、主要研究内容 1、抗原制备与鉴定 无论是制备多克隆抗体，还是单克隆抗体，抗原即PMSG的纯度都至关重要。基本要求是PMSG的纯度应为电泳纯级，毫克量以上。否则，可能影响整个工作的开展。 2、单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备包括小鼠免疫与检测、杂交瘤细胞的融合与筛选、阳性克隆的筛选与扩增、杂交瘤细胞株的建立与鉴定（含染色体鉴定）、抗体的亚类与效价鉴定、抗体的亲和力与特异性鉴定、单抗的制备与纯化、单抗的标记与测定等。 要建立检测试剂盒，必须选出3～5株针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，继续有关特异性、敏感性、稳定性等一系列试验。 3、多克隆抗体的制备 一般选用家兔。主要内容包括免疫与检测、血清的采集与鉴定、抗体的纯化与鉴定、抗体的标记与测定等。 克隆抗体存在的最大缺陷是难于标准化，检测结果不稳定，这也是目前检测试剂盒多采用单克隆抗体的主要原因。 4、检测方法的建立和优化 检测方法的建立和优化包括抗体和抗原最适工作浓度的优化、抗体包被浓度的优化、抗原标准含量曲线的建立、样品检测等。 5、试剂盒的特异性 6、试剂盒的敏感性 7、试剂盒的稳定性 8、其他需要确认的研究（含与上市试剂盒的比较） 二、主要技术路线 孕马血清促性腺激素定量检测试剂盒的主要技术路线与主要研究内容相对应，但抗体是基础，选用单克隆抗体和多克隆抗体均可。 血清采集 ↓ 抗原制备与鉴定 ↙ ↘ 单克隆抗体的制备 多克隆抗体的制备 ↘ ↙ 检测方法的建立和优化 ↙ ↓ ↓ ↘ 试剂盒的特异性 试剂盒的敏感性 试剂盒的稳定性 其他需要确认的研究 三、基本经费预算 在PMSG检测试剂盒研制中，主要花费在以下几个方面： 1、高纯度足够量抗原的获得 高纯度足够量抗原的获得有两个途径，即购买国外纯品和自行制备鉴定。购买国外纯品的价格不详；自行制备鉴定需要条件优化和时间，花费应在1万元甚至更多。 2、单克隆抗体的制备 制备1株PMSG的单抗并不难，花费在1～3万元之间，但制备的单抗是否有用很难预料，要建立3～5株经过系统鉴定的单克隆抗体应在5万元以上。而要建立一种能够应用的检测方法，其难度和投入与研发一种试剂盒（新药）没有多大差别，花费可能在10万元甚至更多，这也是国内没有这种产品上市的主要原因。 3、多克隆抗体的制备 花费不多，只需几千元。如果只是初筛，不要求报批和上市，可采用此途径，但其标准化问题很难解决，甚至无法解决。 4、检测方法的优化确认 需要国外标准试剂盒，具体价格不详。整个试验需要3～5万元（不含标准试剂盒）。 四、可能存在问题（风险因素） 1、抗原问题 抗原是基础。如果购买，不存在任何问题，目前尚不清除费用；自行制备，技术上应该没有问题，但需要时间、耗材和得力的人员。 2、抗体制备 由于单抗存在特异性、亲和力和效价等问题，并需要筛选多株单克隆抗体，而且方法的优化还需要大量的试验工作。要想获得成功，即要工作，也需运气，有一些不确定性，应有思想准备，主要风险也在于此。 多抗的不稳定和难以标准化，不建议单独使用，可考虑与单抗配合使用，但需要优化。 3、试剂盒的确认 试剂盒的确认分两个层次，即合作伙伴的认可和国家管理部门的认可。不同层次的工作量和费用存在很多差异，应予充分重视。 如果考虑申报专利和成为国家标准，更应多方面考虑和权衡。 五、个人看法 根据本人的背景和基础，开发PMSG免疫学检测试剂盒很有前景，在理论和技术上不存在很大问题，关键仍然是时间和经费，特别是遇到问题时的决心和连续性。 据我所知，国内动物用检测试剂盒研制是存在的问题主要技术整合与集成能力较差、缺乏连续性、应用范围有限等。 以上内容，供参考。 4