实验六：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

实验六：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 1、了解脂蛋白及其在体内参与脂类运输的方式； 2、掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 二、实验原理 脂蛋白（lipoprotein）是脂类与蛋白质非共价结合而成的复合物，包括细胞质脂蛋白（细胞的膜系统蛋白与脂质融合）和血浆脂蛋白（广泛存在于血浆中）两大类。血浆脂蛋白是多数脂类在血液中的转运形式，因脂蛋白中脂类的种类、比例不同，因此表现出不同的密度。通常采用密度梯度离心分离，可以将它们分为至少四大类：（1）乳糜微粒（CM）：颗粒最大，脂类含量高达98％，蛋白质含量少于2％，因此密度极低。CM的主要功能为运输外源性甘油三酯（TG）。（2）极低密度脂蛋白（VLDL）：VLDL主要运送内源性TG的形式。VLDL中脂类占85％-90％（TG占55％），其密度也很低。（3）低密度脂蛋白（LDL）及IDL：LDL因VLDL中的TG逐步被吸收利用后形成。颗粒中蛋脂类含量少于25%，胆固醇含量相对提高。（4）高密度脂蛋白（HDL）：HDL主要由肝或小肠合成，是一组不均一的脂蛋白，主要是将胆固醇从肝外组织转运到肝进行代谢。脂蛋白含量最高，因此密度最大。 　 　血浆脂蛋白可以从血液静置、凝胶化后收缩而析出的血清（serum）中分离。除了密度梯度超离心法外，还可以采用醋酸纤维薄膜电泳、丙烯酰胺凝胶电泳以及琼脂糖凝胶电泳等各种电泳方法，其分离原理是根据脂蛋白颗粒的表面电荷密度和分子量的差异，加以分离。 琼脂糖（agrose）是由半乳糖和其衍生物L-2,3-脱氧半乳糖相间排列构成的一种线性高聚物，中性，不带电荷，电渗小，对蛋白质吸附少；形成的凝胶琼脂糖结构均匀，含水量大（98-99%），孔径大，情况类似于自由界面电泳，适合各种生物大分子的分离；凝胶本身透明、无色，不吸附紫外光，因此图谱清晰，可以用紫外光直接检测；胶体易染色，样品易洗脱，还可以制成干膜长期保存，因此是一种优良的电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳操作方法简单，速度快，样品不需要预处理，适合于定性、定量和制备等多种用途，目前被广范应用于临床检测以及蛋白质、核酸等生物大分子的生化分离和鉴定。其分辨率可达0.1?g。 三、实验器材 1．稳压稳流电泳仪：300-600 V，50-100 mA。 2．水平式电泳槽：样品梳10?1 mm 3．玻璃板；4．带盖白磁盘；5．一次性手套 6．滤纸 四、实验试剂和材料 1．巴比妥缓冲液（pH6.8，离子强度0.05）： 称取1.84g巴比妥，10.3g巴比妥钠，用蒸馏水定容到1000 ml。 2．0.5%的琼脂糖：称取琼脂糖，用巴比妥缓冲液配置。 3．17%清蛋白：称取17g牛血清清蛋白，用巴比妥缓冲液水定溶到100 ml。 4．固定液：75%乙醇内含5%乙酸。 5．0.1%氨基黑10B染色液：称取0.1g氨基黑10B，溶于100 ml 甲醇-冰乙酸-水（7：1：2）混合液中。 6．脱色液：乙醇-水（5：3） 7．血清样品：人血清于室温下放置1 hr左右，3000rpm离心10 min， 取黄色上清液（注意不要溶血）备用。 五、实验操作 1、溶胶（24组）：称取1g琼脂糖于锥形瓶中，加入200 ml巴比妥缓冲液，在沸 水浴中加热溶解后，冷却至45-50?C，加入 1ml 17%牛血清清蛋白，轻轻摇匀，吸取表层泡沫。2、电泳槽准备：溶胶的同时，装配好电泳槽，在一侧插好样品梳，平放于桌面。3、灌胶：将琼脂糖倒入电泳槽内，厚度约3-5mm，冷却15-20 min，注意使胶体平整、均匀，不要有气泡。4、点样：待凝胶完全凝固后，取出样品梳，吸去样品孔中多余的水后，用微量进样器进样，每孔约10 ?l 血清样品。 5、电泳：将凝胶槽置于电泳槽内，样品点在负极，在槽内两侧 加入巴比妥缓冲液至与凝胶上表面同高。盖上电泳槽盖子， 接好电源，以稳压模式进行电泳。先将电压稳定在100V， 15分钟后，待样品进入胶内，调至120V，电泳约1hr。6、固定：电泳结束后，将电压、电流调零，关闭电泳仪。取出 凝胶板，将凝胶从凝胶槽内轻轻推入装有固定液的白磁盘 内，浸泡固定30min。7、染色：固定处理后的凝胶片用玻璃板托出，放入氨基黑染色 液中染色10min。8、脱色：用玻璃板托出凝胶片，水洗，除去多余的染色液后， 脱色至背景清晰，可以看清条带。9、实验结果记录：在实验记录本上绘出分离结果，标明条带名 称，计算迁移率。 六、注意事项1．灌胶时，注意凝胶的厚度要控制在3-5mm，过薄则影响上样 量；过厚则可能由于散热不良，在电泳时出现溶胶现象。2．加入的巴比妥缓冲液不宜超过胶面，否则会使点样