人牙周膜细胞原代培养及鉴定.pdfVIP

上 海 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience) 文章编号 ： 0258—5898(2008)l1—1373—04 · 技术 与方法 · 人牙周膜细胞原代培养及鉴定 李 隽， 胥 春， 郝 轶 ， 张富强 (上海交通大学 医学院第九人 民医院 口腔医学院 口腔修复科 上海市 口腔医学重点实验室 上海市 口腔医学研究所 ，上海 200011) 摘 要：目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法。方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1／3的牙周膜组织，分别运用 组织块法 (n=12)、酶消化法 (／1=10)及组织块 一酶消化联合培养技术 (／I=12)培养人牙周膜细胞 。运用免疫组化染色法对 培养细胞的生物学特征加 以鉴定。绘制生长 曲线，观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间。结果 组织块法 、酶消化法和织 块 一酶消化联合培养 的细胞培养成功率分别为 l6．67％ 、20．00％和33．33％。培养细胞 的抗波形蛋 白染色阳性 ，抗角蛋 白染 色阴性 ；碱性磷酸酶染色阳性。细胞生长 曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期，群体倍增时间为 109．79h。结论 成功 进行人牙周膜细胞的原代培养 ，培养细胞具有牙周膜细胞 的生物学特征 。组织块 一酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原 代培养 的成功率 。 关键词 ：人牙周膜细胞 ； 原代培养 ； 生物学特性 中图分类号 ：R780．2 文献标志码 ：B 牙周膜细胞 (periodontalligamentcells，PDLCs) 青霉素，100p~g／mL链霉素)；胎牛血清 (Hyclone)； 是牙周组织内的主要细胞成分 ，不仅合成、分泌牙周 I型胶原酶 (Sigma)；碱性磷酸酶 (仁宝)；鼠抗人角 膜基质中绝大部分 的胶原纤维和蛋 白多糖 ，还有吸 蛋 白抗体、鼠抗人波形丝蛋 白抗体 (Dako)；4％多 收胶原、吞噬异物的能力，在牙周组织的保护、修复 聚甲醛固定液 (自配)。百级层流室；CO恒温细胞培 中起着重要的作用。PDLCs的生命活动状况与牙周 养箱、低温高速离心机 (Heraeus)；倒置相差显微镜 组织健康与否密切相关 ，尤其在牙周膜和牙槽骨 的 (Leica)；电热恒温水槽 (上海精宏实验设备有 限 改建过程中发挥极为重要的作用 ¨。 公司)。 PDLCs原代培养是获取人 PDLCs(hPDLCs)的主 1．2 hPDLCs原代培养 要手段 ，目前国内外对 PDLCs的研究大都采用体外 1．2．1 组织来源及取材 ：征得患者本人及其家长同 培养细胞结合细胞生物学等方法。由于受到牙周组 意后 ，取 12岁左右青少年 因正畸需要而拔除的健康 织的解剖结构和取材数量方面的限制，增加 了原代 前磨牙 (n=34)，立即置于含双抗 (青霉素 100U／mL， 培养 的难度 ，无法快速 、大量地获取细胞 ，常成为影 链霉素 100p~g／mL)的无菌 D．Hanks液 中，用含双抗 响实验进程 的瓶颈。 目前常用的组织块法和酶消化 的D-Hanks液反复冲洗牙根面 ，除去血污。将牙冠 法均存在细胞成活率低、细胞长出时间长等缺陷。 部分浸入 75％乙醇内消毒约 2min。用锐器刮取牙 为了提高细胞体外培养的成功率，本实验分别采用 根面 中1／3的牙周膜组织。 组织块法、酶消化法及组织块 一酶消化联合培养技 1．2．2 组织块法培养 (n=12)：将刮取的牙周膜组 术进行hPDLCs的原代培养，比较成功率；同时对细 织剪成 1mm左右的小块 ，均匀铺于无菌的25mL培 胞的生物学特征加 以鉴定 ，为进一步 的实验研究奠 养瓶底。倒置培养瓶，加入含20％胎牛血清、100U／mL 定基础。