人脐带血CD34^＋细胞的提取及慢病毒载体转染的初步研究.pdfVIP

维普资讯 157O 重庆医学2008年 7月第 37卷第 l4期 · 论 著 · 人脐带血 CD34+细胞的提取及慢病毒载体转染的初步研究 李玉艳 ，梁志清 ，李彩霞 ，潘 静 ，史常旭 (第三军医大学：l_西南医院妇产科；2．1临床血液教研室，重庆 400038) 摘 要 ：目的 探讨人脐带血 CD34 细胞提取 以及慢病毒转染的方法。方法 脐 带血 2O袋，采用直接梯度离心法 ，或 6 羟乙基淀粉沉淀加梯度离心法收集单个核细胞，检测CD34 阳性率，经MACS磁珠分离获得 CD34 细胞，分为完全培养基组、增 强感染剂(ENis)组，过夜培养，每组按 M()Il：1、1：lO、1：5O加入带GFP标记 的慢病毒载体进行转染，每小组再分组分别加入 0、l、5ng／mLpolybrene，转染后 36～48h，3、5、7d分别在荧光显微镜下观察转染情况 。结果 直接梯度法获得 的单个核细胞 中红 细胞含量高 ，CD34 阳性率为0．8 vs1．2 ，MACS分离获得 CD34 细胞 阳性率达 84．6 以上 。转染后观察增强感染剂组感 染率低于完全培养基 组，以MOI1：5O组荧光 最强，但细胞死亡较 多，加 入 5ng／mIpolybrene组 细胞大 片快速 裂解死亡 ，荧光持 续时间短，以MOIl：lO结合 lng／mLpolybrene组阳性率高且荧光表达持续时间长。结论 MOIl：lO结合 lng／mLpolybrene 可能是慢病毒转染较理想的方法 。 关键词：脐血 ；CD34细胞；慢病毒载体；基因转染 中图分类号：R392．4；Q78 文献标识码 ：A 文章编号：1671-8348(2008)14一l570—02 Extraction andgenetransferringby lentivirusvectorinCD34 cellsfrom human cordblood LJYu—yan 。LIANG Zhi—qing ，LICai—xia ，eta1． (DepartmentofGynecologyandObstetrics，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China) Abstract：Objective TocomparethemethodsforCD34 cellextractionandcellgenetransferbylentivirusvector(LTV)． M ethods Mononuclearcellswereisolatedfrom umbilicalcordbloodbygradientdensitycentrifugationonlyorcombiningwith6 hydroxyethylstarch．CD34 cellswerepurifiedbypositiveselectionusing theM iltenyiMACSandFACSanalysed．CD34 cells culturedwithdifferentmediums．GFP—lentivirusvectorwasaddedwith MOIl：1，1：10，1：50respectively，andfollowedwith0，1 ng／mLpolybreneor5ng／mIpolybrene．Cellsbeobservedbyfluorescentmicroscopyat36—48h，3，5，7daftertransfection．Results Afterhydroxyethylstarchmanagement，CD34 cellswereabout1．2 vs0．8 inmononuclearcells．Pre-stimulatedwith cell factors，GFPpositiverateofCD34 cellswashighestbeingtransfecte