猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

‘59‘ 2012年第六届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测 方法的建立及初步应用 申世川1,2，王一成2，姜平1，袁秀芳2，徐丽华2，李军星2 (1．南京农业大学动物医学院，江苏南京210095； 2．浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021) 程中的退火与延伸合并为一步，通过对PCR反应条件的优化，确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积，建立了 bp)、PRV(300bp)和PCV2(469bp)，从而节省临床 多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2，其扩增的目的片断X4,分别为PPV(142 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项 检测时间，同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 PCR技术进行对比验证，结果显示，两者的总符合率为95％以上。表明建立的多重PCR检测方法，具有高度特异、快速、敏感等特点，可用于 对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 关键词：PPV；PRV：PCV2；多重二温式PCR (CH一1R株)购自上海海科生物药品有限公司(生产 猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)、猪伪狂 virus，PRV)和猪圆环病毒2 犬病毒(pseudorabies circocims (SAl4．14—2株)购自湖南亚华种业有限公司生物药 型(porcine type2，PCV2)等，是目前常 见的引起猪繁殖障碍的DNA病毒。目前，很多猪场 都同时存在上述3种病毒引起的疾病，给养猪业造成 保存，pMDl8一T载体购自大连宝生物工程有限公司。 巨大的经济损失。以上3种病毒常呈现混合感染，在 1．2工具酶及主要试剂 TaKaRaDNA I临床上以受感染母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病 rTaq 弱仔猪为主要特征，不容易区分。常规单项PCR一 xGCBuffer 次只能检测一种病毒，费时费力，多种病因混合感染 时，难以应用常规方法进行早期快速检测。多重 赛百盛基因技术有限公司；M-MLV反转录酶、Ribo· PCR可以同时检测多种病毒，方便快捷，省时省力。 nuclease 国内外猪病现有诊断技术主要包括临床诊断、病 回收试剂盒和质粒DNA提取试剂盒均购于上海生工 RNA 原诊断、血清学诊断，分子生物学诊断等。临床诊断 Mini和 生物科技有限公司；QIAGEN固Viral RT．PCR 主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病 QIAGEN@OneStep Kit试剂盒均购自吉泰生 种类，难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的诊 物科技有限公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自 断方法，特异性高，可直接确诊，但病毒分离所需时 上海博彩生物技术有限公司(K201)；其余均为国产 或进I=1分析纯试剂。 间较长，成本较高。本试验针对PPV、PRV和PCV2 3种猪常见DNA病毒病建立了三重二温式PCR快速1．3引物设计与合成 检测方法，可以在同一反应体系中特异地扩增出3种 病原体的核酸片段，缩短诊断时间，有利于快速高效 列，对其进行比对分析，找出各自的保守序列，确定