应用套式RT-PCR检测实验大鼠和野鼠汉坦病毒.pdfVIP

第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 实验动物 应用套式RT-PCR检测实验大鼠和野鼠汉坦病毒 刘忠华，袁文，王静，黄韧 (广东省实验动物监测所，广州510260) 我国是肾综合征出血热危害最为严重的国家，肾综合征出血热是由汉坦病毒引起的以发热、 出血和肾脏损害为主要临床表现的烈性传染病n’23。2001年，正当我国“申奥”的关键时刻，北 京发生了因使用质量不合格实验动物和动物实验不规范致使鼠源性人兽共患病流行性出血热感 染和师生紧急预防接种的重大事件。2006年，东北三省由于个体户繁养暨长途贩运不合格实验动 物致使三省分别有几名甚至几十名教学科研人员感染流行性出血热重大疫情。广东也在1990年、 1997年、1999年和2007年分别出现的科技人员使用不合格实验动物而感染人畜共患病的严重生 物安全事故，经过有效处理，虽然未造成人员死亡，但提醒我们要高度重视并警觉我们随时有可 能爆发鼠源性人兽共患病公共卫生和社会安全隐患。因此，应用快速敏感的检测方法对汉坦病毒 进行早期诊断有着十分重要的意义。 本文主要应用套式RT-PCR方法检测广州市的实验动物大鼠和野鼠携带的汉坦病毒。对检出 汉坦病毒的动物种群立即销毁，对相应场所进行彻底消毒，以防汉坦病毒的传播。 l 材料及方法 1．1 病毒和待检标本 汉坦病毒来源于中国药品生物制品检定所，待检标本来源于广州市某单位实验动物大鼠及其 周围的野鼠肺组织样本110份，由本实验室保存。 1．2 主要试剂 公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。 1．3 引物设计 根据GenBank已发表的EHFV基因序列，分别设计一对外引物和两队针对汉滩型、汉城型EHFV 的内引物，具体如下： 逆转录引物： EHF—cDNA：5-TAGTAGTAGACTCC一3 通用外引物： EHF—OUT-F1：5-AAAGTAGGTGITAYATCYTIAC从TGTGG-3 E}lF一伽T-B1：5-GTACAIcCTGTRCCIACCCC-3 型特异性引物： 汉滩病毒： EHF—HTN_F2：5-G从TCTATATTGTGGGCTGC从GTGc一3 EHF—rHTN-B2：5-GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC一3 汉城病毒： EHF—SEO—F3：5一GTGGACTCTTCTTCTCATTATT一3 142 实验动物 第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 EHF—SEO—B3：5一T(×；(Ⅺ从TCT(×；‘；‘××；TTGCA．I．G一3 1．4 鼠肺组织的处理 将鼠肺组织放入研钵中，用剪刀尽量剪碎，加入适量PBS，快速研磨，尽量将肺组织磨成匀 浆液，用吸管将液体吸入2mL的EP管中，10000rpm离心10min，取上清液进行核酸提取。 1．5 病毒RNA提取 用Trizol提取病毒HA，具体操作步骤见说明书。 time 1．6 Real RT堋 1．6．1 反转录反应 在DEPC处理的0．5mL的Eppendorf管中依次加入以下试剂： RNA模板 3uL L 5×反转录缓冲液4u dNTPs(2．5mmol／L) 2uL L) luL 逆转录引物(20pmol／ll AMY反转录酶 1pL L RNA酶抑制剂0．5u pL 力ⅡddH20至20 42℃作用1h，70℃10min，置于冰上。 1．6．2 第一轮PCR 按下列组份配制PCR反应液 cDNA 4laL， 10×PCRbuffer 2IIL， dNTPs 2laL， 0．5 EHF—OUT—F1 UL， primer EHF—OUT—B1 ’0．5IJL， pri