运用培养基的细胞培养技术.docVIP

运用培养基的细胞培养技术动物细胞大规模培养技术集中在细胞系、细胞培养基和细胞生物反应容器三个方面，构成生物制品生产的必要条件。 　　其中细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响蛋白的表达量或病毒的滴度，故筛选、驯化优质细胞是关键。而只有好的细胞培养基才可能筛选、驯化出优质的细胞。 　　细胞生物反应容器也在不断发展，以转瓶、反应器为主要细胞生产设备，配合高密度培养、微载体培养、悬浮培养技术，均需要相适应的细胞培养基以充分发挥作用,获得高表达、高产量，降低生产成本。　　动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。蛋白治疗药物如糖蛋白、抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产能力。 　　动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染;更为精确有效的工艺控制手段;规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。 　　　细胞培养技术对生物制品成本的影响 　　表达量提高 　　通过细胞培养技术的不断改进可以充分利用现有设备，大幅度提高生物制品表达量，降低生物制品的单位制造成本;同时，由于产量提高并不新增固定资产投资，也带来生物制品的单位固定成本的降低。 　　因此提高表达量可以有效降低生物制品的单位成本，既降低变动成本，也降低固定成本，使得制品利润率提高，市场竞争能力增强。 　　培养液成本降低 　　在很多使用牛血清的细胞培养液中，为牛血清支付的成本远远高于培养液中的细胞培养基等其它成分，因此通过采用低血清细胞培养基，降低牛血清用量，可以降低细胞培养液总成本。 　　纯化成本低，制品安全性提高 　　牛血清的使用量不仅增加了细胞培养液的成本，更严重的是带来动物来源成分、杂蛋白，以及不安全因素，这些成分越多，纯化的成本越高、生物制品原液损失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、无血清培养细胞可以有效降低纯化成本何损失，提高生物制品成品率和利润率。 　　综合成本降低 　　动物细胞培养技术是生物制品产业化的核心技术之一，在生产中，应该系统、全面的研究细胞培养技术对生物制品成本的综合影响，不断追求最佳的细胞培养技术，提高生产效率，有效降低生物制品成本，提高利润率，增强产品市场竞争力。 　　细胞生存条件 　　1.基本营养物质 　　(1) 糖 　　六碳糖主要能源、维持渗透压，含葡萄糖1-5%。 　　(2) 氨基酸 　　维持生存需12种氨基酸(精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪、缬)。谷氨酰胺需量最大,缺乏时细胞生长不良。 　　单细胞培养或细胞量少时,所需氨基酸的种类和量增多，细胞主要利用左旋氨基酸异构体。 　　(3) 维生素 　　细胞大部分需水溶性B族维生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促进正常细胞生长繁殖。 　　2.促生长因子、激素类物质 　　3.其它物质 　　基本元素、微量元素、促细胞贴附物质(纤粘连蛋白、层粘连蛋白laminin、IV型胶原、氨基多糖类) 　　4.水 　　主要成分和生存环境,要求高纯度水。 　　5.温度 　　哺乳动物及人源细胞最适培养温度为35℃—37℃,对低温耐受力比高温强。39℃以上受损→死亡;不低于0℃时(0℃-34℃)，细胞能生存，但代谢降低、分裂延缓。 　　6.气体环境和pH 　　需O2、CO2 ，通氧量过大对细胞有毒害。CO2主要与维持pH有关，细胞培养最佳pH为7.2—7.4，通过缓冲系统和调节CO2含量，维持正常pH。开放培养要求5%CO2环境、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH变化。 　　含Earle’s缓冲系统的培养基适合于5%CO2的培养条件，Hanks’缓冲系统的培养基仅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。 　　7.湿度和光 　　开放培养相对湿度控制在95%。细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力。 　　8.影响细胞生长的其它因素 　　接触橡胶用品、收集细胞时离心速度过大、细胞接种浓度过低等。