（一）细菌基因组DNA的提取：(a)extractionofbacterialgenomicDNA.docVIP

（一）细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。 2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤： 1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2） 加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温20分钟。 5） 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL ( 55 °C, 750 rpm, 2hr ( +150 μL 6M NaCl, vortex ( spin 5 min, Max, romm temperature (RT) ( isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex ( spin 5 min, Max, RT( precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex ( spin 5 min, Max, RT ( precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. （三）Chelex法抽提DNA 用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。 取1.5m试管，加双蒸去离子水1m，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出 12000rpm离心5分钟，弃上清 加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL，置50水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟，灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性 取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20保存备用 （四）新鲜血DNA提取 将约3m的血块导入匀浆管中，加入8m的裂解液进行研磨，直至血块磨匀。转入50m的离心管中，再加入30m的裂解液，6000转离心10min，弃上清液。 在沉淀中加入20m的裂解液，充分震荡后6000转离心10min，弃上清。 在沉淀中加入了1m的抽提液和15μL的蛋白酶K，混匀后转入5m离心管中，37°的水浴过夜或者50°水浴3小时。 过夜的水浴液体中加入1m的Tris饱和酚（注意的是Tris饱和酚分为液相在上层，油相在下层，加入液体必须是下层的油相物），混匀后（手摇15min），4000转离心10min，取上清液体。。 在上清液体中加入等体积的的氯仿和异戊醇的混合液体（氯仿：异戊醇=24：1），充分混匀后（手摇15min）4000转离心10min，取上清液（分入两个1.5m的离心管中，各约600μL—800μL） 在上清液体中加入3M的醋酸钠80μL，再加入与上清液体等体积的冰无水乙醇（-40保存），上下轻摇。可以见到白色絮状沉淀物，再以10000转/10min离心。 在沉淀中加入冰无水乙醇约1m，12000转/6.5min离心，弃上清后真空抽干。 干燥后产物加入TE缓冲溶液10μL溶解，4放置五天，期间可以在摇床上晃动，然后测量浓度和OD值，然后稀释到0.1ug/μL，分装后放入-20保存。 使用分光光度仪器测量DNA的OD 值的时候，首先是使用酒精清洗那个放入的内盒内外，然后使用TE缓冲液冲洗数遍，然后加入TE缓冲液，放入插孔，调零，然后倒掉TE缓冲液调零，加入1μL的DNA母液+49μLTE缓冲液（或2μL的DNA母液+98μLTE缓冲液），放入后测量OD值和浓度，即为母液的浓度。