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V01．20
第20卷 增刊 农业工程学报 Suppl
100 2004年 7月 TransactionsoftheCSAE 2004
July
葡萄卷叶病毒IllRT—PCR检测技术研究
牛建新1’2，陈 萍1，李西平1，马兵钢1’2，鲁晓燕1’2
(1石河子大学农学院园艺系，石河子832003；2新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，石河子832003)
的影响，确立了GI。RaVRT—PCR的优化体系。
关键词：葡萄卷叶病毒Ⅲ；RT—PCR检测
中图分类号：s6芍*山一Q趵8十一s435却31 文献标识码：A
f
，
根据已发表的GLRaVm的序列设计合成引物，特异引
0 引 言
栽培无病毒苗木是防治果树病毒病的有效途径之
一，而对苗木病毒检测水平的高低直接影响无病毒苗的 上海生物工程公司合成。两引物间序列长为300bp。其他
推广。在传统检测技术方面国内外均已做了大量研 常规试剂均为国产分析纯。PCR仪为上海复生公司产的
究[1]，也取得了一定进展。不过传统的检测方法灵敏度 FS-919型DI恤自动扩增仪。
低，周期长，且受季节限制。随着分子生物訾不断发展， 1．3试验方法
分子检测技术也开始在果树病毒检测中应用，20世纪 1．3．1 总RNA的提取方法
90年代以来，美、欧、日等发达国家已开始了利用PCR
技术研究果树病毒的检测工作[2’3]，并取得了很好的效磨成粉末状，迅速移入1．5mL
果，我国在这方面则刚刚起步H’5]。
本试验通过研究影响RT—PCR扩增的因素，建立
了以总RNA(或dsRNA)为模板的GLRaVⅢ的RT—
PCR的检测体系，大大提高了果树病毒的检测灵敏度。 15
该技术应用于果树病毒检测，有利于我国果树无病毒苗 溶液，混匀，4℃12000r／min离心15min；(4)取上相，
NaAC
的推广和检疫工作的开展。 加2．5倍体积的无水乙醇和1／10体积3mol／L
(PH
5．3)，混匀，一20℃放置3h。4℃12000r／rain离心
1材料和方法
15
1．1供试材料 干燥后，溶于40／-L
总RNA和dsRNA的提取以及RT—PCR体系建立存备用。
均用石河子大学农学院果树实验站已知带卷叶病毒的
葡萄病株，以叶片和皮层为试验材料。田间样品的RT— 末状，迅速移入1．5mL
PCR检测随机采集资源圃和生产用葡萄园的葡萄叶 提取缓冲液和800t-L热酚，振荡30s，4℃12000r／rain
片j无病毒的实生苗为对照。
1．2供试试剂 仿：异戊醇(25：24：1)溶液，混匀，4℃12000r／min
逆转录酶AMV(附5×buffer，250mmol／LTris·离心15min；(3)取上相，加入2．5倍体积的4mol／L
DNA多聚酶、DNA／HindIllMark—
CI(PH8．3)、Taq
ers、PCR TE(PH
Markers、TE(PH8．0)，5×Teb、EB250t．￡L
戊醇抽提两次。4℃12000r／rain离心
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