糖化酶固定化试验1.docVIP

糖化酶的固定化试验 一、目的要求 本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。 二、基本原理 游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。 1g 固体酶粉（或1ml 液体酶），于40℃、pH 值为4.6 的条件下，1h 分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖，即为1 个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。 仪器和设备： 1、 实验用乳化机WL500CY，注射用筒50mL 6号针头，冰箱，恒温水浴锅、比色管。 2、 其它实验常用玻璃仪器。 3、 试剂和溶液 （1）乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH 为4.6）。 称取乙酸钠（CH3COONa·3H2O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH） 2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用pH 计校正。 （2）硫代硫酸钠标准溶液（Na2S2O3，0.05mol/L）。 （3）碘溶液（1/2I2，0.1mol/L）。 （4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1mol/L）。 （5）200g/L 可溶性氢氧化钠溶液。 （6）硫酸溶液（2mol/L）。 （7）20g/L 可溶性淀粉溶液。 （8）10g/L 淀粉指示液。 (9) 1%氯化钙溶液 四、实验内容 1、 糖化酶的酶活测定 2、 糖化酶的米氏常数测定 3、 根据所学知识设计糖化酶的固定化方法（重点为包埋法） 4、 设计试验对固定化后的糖化酶进行表征。(固定化酶的活力,活力回收测定,固定化酶的半衰期,固定化酶的Km测定) 五、实验步骤 （1）待测酶液的制备 称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。 （2）测定 于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。 （3）计算 X＝（A－B）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2＝579.9×（A－B）c×n 式中 X——样品的酶活力（u/g或u/ml） A——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml） B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml） c——硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L） 90.05——与1ml硫代硫酸钠标准溶液（1mol/L）相当的以克表示的葡萄糖的质量 32.2——反应液的总体积（ml） 5——吸取反应液的体积（ml） 1/2——吸取酶液2ml，换算为1ml n——稀释倍数 2——反应30min，换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数 3、 米氏常数测定 配制2%浓度的可溶性淀粉溶液，用5支试管分别加入2,4,6,8,10mL，不足的补加蒸馏水至10mL。分别加入相同的酶液，测酶活。 4、 固定化方法 将酶液15mL与3%的海藻酸钠溶液150mL混合搅拌，然后加入3%的明胶溶液150mL混合乳化约10min，调pH4，慢速搅拌并降温至5~10度，通过6号注射器的针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4度，硬化30min。 游离酶 固定化酶 甲 乙 甲 乙 Na2S2O3浓度（mol/L) 稀释倍数（n） Na2S2O3消耗体积V（ml） 酶活力X（u/g) 实验数据记录表 酶粉质量=（ ） 表1 酶活力测定数据记录表 序号 1 2 3 4 5 甲 乙 甲 乙 甲 乙 甲 乙 甲 乙 可溶性淀粉溶液浓度（g/l) 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 加入酶液量（ml） Na2S2O3浓度（