人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧复氧模型的建立.pdfVIP

132 心肺血管病杂志2015年2月第 34卷第2期 JournalofCardiovascularPulmonaryDiseases~February2015,Vo1．34,No．2 DOI：10．3969／j．issn．1007-5062．2015．02．015 基 础研 究 · 人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧／ 复氧模型的建立 鲁 昆 王月丽 王海红 关 啸 王绿娅 辛 毅 褚小玲 林 煌 [摘要] 目的：培养人真皮微血管内皮细胞 ，建立人真皮微咀管内皮细胞低氧／复氧模型。方法：采 用酶消化及联合磁珠分选法，得到人真皮微血管内皮细胞 (HDMECs)，体外培养传至 P5代 ，采用Ⅷ因子 免疫荧光及 CD309、CD34流式细胞学进行鉴定。用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理 P5代 HD— MECS。实验分为四组，Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组 ，H8R12组低氧8小时复氧 12小时组 、 H8R24组低氧8小时复氧24小时组。TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 口末端标记法)染 色法检测细胞凋亡，蛋白质印迹法 (WesternBlot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶一3(Caspase一3)蛋 白的表 达。结果：联合法分离的细胞 ，经过 2次 CD31磁珠分选后 ，可见细胞短梭形 ，呈铺路石样。细胞传至 P5，Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为 (95-4-2．61)％。流式细胞仪检测 CD309阳性率为 (95．4±1．34)％； CD34阳性率为(42．5±3．23)％。TUNEL染色 、WesternBlot结果显示 ：H8组的细胞凋亡率和活化的 Caspase一3表达高于Con组 (P0．05)，H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase一3表达高于 H8 组 (P0．05)。结论：本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs，并且建立了HDMECs低氧／复 氧模型，为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础。 [关键词] 人真皮微血管内皮细胞；低氧／复氧；细胞凋亡 [中图分类号】 R54 [文献标志码】 A [文章编号】 1007-5062(2015)02-132-05 Primarycultured and establishmentofhypoxic／reoxygenation modelofhumandermalmicrovascular endothelialcells LUKun，WANGYueli，WANGHaihong，GUAN Xiao，WANGLvya，XIN H ，CHUXiaolin，LING Huang UniversityofSouthChina，Hunan421001，China [Abstract] 0bjective：Usingenzymaticdigestionandmagneticbeadseparationcombinedmethodtoex— tracttheflapmicrovaseularendothelialcells，createanendothelialcellmodelofhypoia／reoxygenationmodelin vitro．Methods：usingenzymedigestionandcombinedmagneticbeadseparationmethodtogetpeopleflapmi— crovascularendothelialcellsculturespreadtotheP5Invitro，usedimmunofluorescenceandfluidcytologytoi— dentificationit．AdoptthemethodofoxygenBufferwithlowoxygentankprocessingP5HDMECs，Experimentis dividedintofourgroups，Connotdoanyprocessing，H8rgouphypoxia8hgroup，H8R12reoxygenation12haf- terhypoxiaof8h ，H8R24reoxygenation24hafterhypoxiaof8h．Percentageofapoptosiscellswasdetectedby TUNELstainingmethod(TdT—mediated