龙眼胚性愈伤组织体胚发生的形态学观察及其DNA和RNA提取方法研究.pdfVIP

龙眼胚性愈伤组织体胚发生的形态学观察及其 DNA与RNA提取方i 究’ 王凤华 ‘赖钟雄’郑金贵2 吕柳新’ (1福建农林大学亚热带果树研究所 2福建农林大学生物技术中心 3福建农林大学园艺学院 福州 350002) 摘 要:通过控制2,4-D、蔗糖浓度和培养时间，获得了龙眼胚性愈伤组织体胚发生各个阶 段高度同步化的胚MK培养物;采用倒1显徽镜观察结合直接观察发现，龙眼胚性愈伤组织的体 细胞胚胎发生依次经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚、成熟体胚等阶段.对龙眼体胚 发生主要发育阶段的胚性培养物进行了。1A.RNA提取方法研究，获得了完整、高质量的DNA 和RNA，摸索出了一套简便、J决捷、有效的DNA提取方法，并对提取的RNA进行了反转录及PCR 扩擂试验，为龙眼体细胞胚胎发生的分子生物学研究英定了重要基础. 关健词:龙眼体细胞胚胎发生 DNA RNA 提取 龙眼 (DiwcarpusIovganLour.)属无患子科 ((Sapindaceae)龙眼属，是起源于我国的一种重要 亚热带木本果树。关于龙眼体细胞胚胎发生的研究，在80年代就有若干报道，从龙眼的子叶培养伙 花药培养月【、焦核胚胎挽救”‘、成年树叶片培养’。等通过体胚分牛涂径获得再生植株;到了90年代， 龙眼的体胚发生研究有了突破性进展”【，赖钟雄等在近10年来建立了龙眼胚性愈伤组织、悬浮培养细 胞、原生质体等高频率体胚发生和植株再生系统 【川‘，这是目前木本植物最优良的体胚发生系统，可作 为木本植物体细胞胚胎发生的实验模式系统u【,ul。由于体细胞胚胎发生过程与合子胚胎类似，即类似的 分子机制调控着在体内 (二 “vo)和离体 (二vitro)的胚胎发生过程，而且体细胞胚胎发生过程可以 在离体条件下人为控制，被认为是研究胚胎发生机制和分离胚胎发育相关基因的良好替代体系工，‘]。体细 胞胚胎发生途胫是细胞全能性表达最完整的一种方式J‘l，它重演了合子胚形态发生过程，深人研究体细 胞胚胎发生与发育的分子机制对于揭示细胞分化、发育、形态发生、合子胚发育等重大理论问题的机制 及植物品种改良、胚胎发育相关基因分离、基因工程研究等都具有重要意义。龙目ib进行龙眼体胚发生机 制的研究，不咬刀寸于龙眼的生物技术研究有重要意义，而月口寸于其它木本植物的体胚发生研究也有一定 的借鉴作用.龙眼体胚的发生机制，赖钟雄.陈春玲等已作了初步研究15‘-17)。龙眼离体胚性培养物的 DNA和RNA提取 是龙眼体胚发生的分子生物学研究的重要基础工作，虽然有不少作者对木本植物的DNA 和朋A提取方法进行过研究，仁D寸于木本植物胚性培养物的DNA和RNA提取方法的研究尚非常少见。本 研究利用龙眼体胚发生系统这个独特的离体培养系统，在胚性愈伤组织体细胞胚胎发生的形态学观察的 基础上，进行龙眼体胚发生不同发育阶段的离体胚性培养物的高质量DNA和RNA提取研究，以期用于进 一步的龙眼体胚发生的分子生物学研究。 1材料与方法 1.1龙眼胚性愈伤组织体胚发生的诱导 本试验所采用的龙眼 (品种为 “红核子”)胚性愈伤组织 (LCZ细胞系)，由本研究所赖钟雄博士于 1994年诱导并长期继代保存摘养基为附加2,4-Dlulg/L,蔗糖20g压的ms培养基 培‘养基代号M1)neo 防的培养基，，分分别别为: 根据赖钟雄的研究结果设计获得龙R)还性愈伤组织体胚发生不同阶段培养物 Md:附 57 加2,4-DO.lmg/L,蔗搪20g/L的MS培养基;M3:附加蔗糖20/L的MS培养基:M4:POP蔗糖SOg/L 的MS培养基。以上4种培养基皆附加喇旨7g/L,pH5.8。在M2,M3,M4培养基上，经过一定的培养 程序，获得不同发育阶段的胚性培养物。培养条件为((2512)℃、黑暗。在Nikon万能倒置显微镜下， 观察胚性培养物发育阶段，并显微摄影。成熟体桩用普通照相机拍照。根据龙HE还性培养物形态学观察 结果，挑取不同发育阶段的胚性培养物用于下面的皿 、RNA提取。 1.