产酸克雷伯氏菌M5al普鲁兰酶的异源表达及酶学性质研究.pdfVIP

第 45卷 第 1期 工 业 微 生 物 Vo1．45No．1 2015年2月 IndustrialMicrobiology Feb．2015 doi：10．3969／j．issn．1001—6678．2015．01．007 产酸克雷伯氏菌 M5al普鲁兰酶的异源表达及酶学性质研究 温亮亮， 郭 佳， 关 锋 江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122 摘 要：普鲁兰酶 (EC3．2．1．41)是一类淀粉脱支酶，能够特异性水解淀粉中的仅．1，6．糖苷键，从 而提高淀粉的利用率，在以淀粉为原料的食品、纺织、生物燃料和洗涤剂等行业中具有重要的应用 价值。本研究以产酸克雷伯氏茵KlebsiellaoxytocaM5al基因组DNA为模板，将PCR扩增得到的普 鲁兰酶基因pulA克隆至表达载体 pET28a(+)，构建好的重组质粒转化大肠杆菌Escherichiacoli BI21(DE3)，在培养基中添加0．5mmol／L异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)的条件下对该酶基因进行 诱导表达，经镍柱纯化获得重组普鲁兰酶用于酶学性质研究。SDS．PAGE及WesternBlot检测显示 普鲁兰酶基因pulA在上述大肠杆菌宿主中成功获得了表达。该重组酶最适反应pH5．5，最适温度 60o=【。金属离子对酶活性有一定影响。Mn“对酶活促进作用显著；Fe“、Mg¨、Fen对酶活只有微 弱的促进作用，而Cun对酶活造成强烈抑制。来源于KlebsiellaoxytocaM5al的普鲁兰酶最适催化 条件符合工业生产中淀粉糖化工艺的要求，具有应用于淀粉工业的潜力。 关键词：产酸克雷伯 氏茵；普鲁兰酶；畀源表达；蛋白纯化；酶学性质 普鲁兰酶(Pullulanase，EC3．2．1．41)是一类淀 产酸克雷伯 氏菌 KlebsieUaoxytoca是革兰 氏阴 粉脱支酶，能特异性识别并水解支链淀粉中的 ．1， 性菌，具有将碳源转化为多种化学原料或生物能源 6一糖苷键，该酶将淀粉中的侧链切下以形成直链淀 如乙醇、氢气 、1，3．丙二醇、1，3．丁二醇 等的能 粉，增加了淀粉的可溶性，从而便于淀粉的进一步水 力。目前已分离到多种克雷伯氏菌菌株用于工业生 解及利用，大幅度提高了淀粉的利用率 ¨4。。普鲁兰 产。产酸克雷伯 氏菌KlebsieUaoxytocaM5al全基因 酶主要应用于淀粉的糖化阶段，可以与 淀粉酶、 组序列已测通并收录至 NCBI数据库 ¨，且该菌没 B一淀粉酶或葡萄糖淀粉酶协同作用生产工业原料麦 有整齐多糖包被，更易进行基因操作，有利于该菌的 芽糖或葡萄糖，也可单独应用于生产直链淀粉 ]。 基 因改造及工业应用。本文 以 Klebsiellaoxytoca 通常淀粉糖化阶段 pH为4．5～5．5，温度在55cCl～ M5al所产普鲁兰酶为研究对象，采用 PCR方法克 6OcCl ，这种苛刻的高温弱酸性工艺条件，使得能 隆得到该菌株基因组中的普鲁兰酶编码基因pulA， 够实际成功应用于淀粉工业的普鲁兰酶很少。 尝试在大肠杆菌宿主中对该酶基因进行异源表达 ， 研究者筛选到芽孢杆菌 ]，克雷伯 氏菌 1【，嗜 并考察了纯化所得重组普鲁兰酶的酶学性质，为该 热古菌¨等能够分泌普鲁兰酶的微生物菌株，并考 酶的工业化应用奠定了理论基础。 察了其所产普鲁兰酶的酶学性质，但只能停留于实 1 材料与方法 验室研究阶段，能够应用于工业生产的酶极少。商 品普鲁兰酶的市场长期被美国杰能科与丹麦诺维信 1．1 实验材料 等公司垄断，因此寻找适用于工业生产的普鲁兰酶 1．1．1 菌株及表达载体 是打破国外垄断亟需解决的问题。 大肠杆菌 JM109、BI21