DNA连接反应与其问题分析.pdfVIP

http// service@ DNA连接反应及其问题分析 一、DNA 连接介绍 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５磷酸和相邻的 3羟基之间 形成的新 的共价链。如质粒载体的两条链都带 5磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化， 则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感 受态细胞后可被修复。相邻的５磷酸和３羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催 化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌 体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮ Ａ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是 如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切 割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ 分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子 的末端的概率）。这倦，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度 有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也 有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk 等(1 975; 同时参见 Bethesda Res,Lab.出版的 Focus 第 2 卷，第２、３期合刊)从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连 接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j 和 i。j 是ＤＮＡ 分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j 的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的 ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j 与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不 可能相互作用），因此 j 对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j ＝[3/(3πlb0)]3/2 其中 l 是ＤＮＡ长度，以 cm 计，b 是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b 的值以缓冲液的离子强度为转移， 而后者可影响ＤＮＡ的刚度。 i 是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链 dna 而言，i=2NoMx10-3 末 端/ml 这里Ｎo 是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i 时，给定ＤＮ Ａ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条 件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当 ji 时，有利于重新环化；当 i j，则有利于产生多联体。图 1.9 显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中 j:i 之比分别为 0.5、1、2 和 5 时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk 等，1985）。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状 质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基 因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当 i 是j 的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时） 外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约 40 ％ 都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3 ）而带匹配末端 http// service@ http// service@ 的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。 涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含： １）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i1 和 j:i3 。对一个职 pUC18 一般大小的质粒，这意味着连接反应中应 含有载体ＤＮＡ为 20-60μg/ml 。 ２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得