人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达.pdfVIP

中国生物工程杂志China Biotechn0109y，2006，26(7)：13～18 人B干扰素·血清白蛋白融合蛋白在 毕赤酵母中的分泌表达 雷楗勇 张莲芬杨健良金坚’ (江南大学生物工程学院教育部工业微生物重点实验室无锡214036) 摘要利用重叠PcR技术在体外拼接IFNB和HsA基因，将得到的融合基因插入到毕赤酵母分 泌型表达栽体pPIc9K中，置于启动子AOxl和“交配因子信号肽的作用下，分泌表达融合蛋白 得到高拷贝转化子。PCR鉴定后，用甲醇诱导表达，sDs—PAGE和westemblot分析表达的融合蛋 液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU／m1。 关键词B干扰素巴斯德毕赤酵母融合蛋白 中国分类号Q786 干扰素(interferDn，IFN)是一类具有抗病毒、抗增 1材料与方法 殖和免疫调节等生理活性的细胞因子，主要分为I型和 1-1材料 II型2类。IFNB属I型，和IFNd共用同一受体，它是 由成纤维细胞分泌的一种糖蛋白，由166个氨基酸残 1．1．1 质粒、菌株、病毒和细胞株毕赤酵母m^m 基组成，分子量为22～23kDa”。1。用于临床的IFNB 主要有2种：IFNB—la和IF邯一1b，其中IFN0·Ia为天然 c旃 II DH5q和克隆载体pBlues矗ptI(s(+)由本校微生物 的IFNB；IFNB一1b为由原核系统表达的IFNB，其cysl7 为s。所代替。由于IFNB分子量较小，易被肾小球滤 过，因而在体内的半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的 半衰期一般在8h左右。为了达到治疗效果，一般需要 保存；疱疹口炎病毒VsV和w玲H细胞，由苏州大学杨 吉成教授惠赠。 频繁大剂量用药，如隔日一次，每次6×106Iu，而多发 性硬化症等疾病的治疗周期较长，频繁大剂量用药不 1．1．2工具酶与试剂 仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生严重 内切酶＆oRI、№I、T4DNA连接酶、酵母抽提物、蛋白 的毒副作用。为了克服上述缺点，我们利用人血清白 胨、酵母氮基YNB均购自上海生工生物工程服务有限公 蛋白融合技术(albuIllin如8ion technology)构建了人口 干扰素和血清白蛋白的融合蛋白，通过分泌型表达载 自上海华新生物高技术有限公司，HSA多克隆抗体购 自成都生物制品所，其余试剂均为分析纯试剂。 体pPIc9K，将IFNB-HsA融台基因整合到巴斯德毕赤 酵母染色体中，在分泌信号肽的作用下分泌表达融合 GACCT^。CAACTr(Z1TGGA-3’，P＆：5 蛋白IFNB-HsA，为开发长效人IFNB奠定基础。 收稿日期：2006．02之l修回日期：2006．04一14 +·通讯作者，电子信箱：ji唧ian31@hotⅢ越l-com 万方数据 14 26No．7 中国生物工程杂志chinaBiotechnology volr 2006 E西Ⅲ酶切位点，Pf4的下划线部分为ⅣofI酶切位点。以 上引物由华大中生科技发展有限公司合成。Pn和眦 用于扩增I硎B基因，PO和P饵用于扩增HsA基因。梨酵，混匀后各取200山分别涂布于3块含有1mo