辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性.pdfVIP

第34 卷 分析化学 （FENXI HUAXUE ） 研究简报 第6 期 2006 年6 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 821 ～ 824 辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性 1 2 1 1 李忠琴 许小平 杨海麟 王 武# 1 （江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036 ） 2 （福州大学化学化工学院，福州350002 ） 摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚- 4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的 新方法。确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000 U/ L ，4-氨基安替比林（AAP ） 1 mmol/ L ，苯酚（PA ）6 mmol/ L ，黄嘌呤（XAN ）1 mmol/ L 溶于50 mmol/ L Tris-CL 缓冲液（pH 8. 4 ）；反应温度 为37 ℃ ，保温时间为20 min ；检测波长为508 nm 。本方法测定XOD 酶活的线性范围为5. 0 ～ 100 . 0 U/ L ，线性 关系良好（r = 0 . 9992 ），检出限为1. 3 U/ L 。该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。可有效应用于普通实 验室和临床常规生化检测。 关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法 1 引 言 黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2 . 3. 22 ）是一种钼羟类胞质缀合酶。主要用于痛风、 心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1 ～ 3 ］。目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用 ［4 ～ 8 ］ NBT/ MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法 等方法。但比色法形成的显色物 溶解度低， PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。紫外分光光度法中黄嘌呤 和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求 ［9 ］ 高而难于推广。本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ） 和黄嘌呤氧化酶的反应特 性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。 2 实验部分 2 . 1 仪器和试剂 U-300 型紫外-可见分光光度仪（日本日立公司）；H. H. S 11-2R 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）； 高速冷冻离心机（日本Hitachi CR22G 型）。0 . 67 U/ mg 黄嘌呤氧化酶（Sigma 公司）；250 U/ mg 辣根过 氧化物酶（上海双向西巴斯科技有限公司）；4 -氨基安替比林（AR ，华东师范大学化工厂）；苯酚（AR ，国 药集团上海化学试剂公司）；黄嘌呤（99% ，Fluka ）；Tris（BR ，国药集团化学试剂有限公司）；HCL（AR ，国 药集团上海化学试剂公司）；叠氮钠（BR ，厦门新隆达试剂有限公司）。 2. 2 实验方法 配制反应显色液：4 -氨基安替比林（4 -Aminoantipyrine ，AAP ），1 mmol/ L ；苯酚（phenic acid ，PA ）， 6 mmol/ L ；Tris-HCL 缓冲液，50 mmol/