乙肝病毒X蛋白促进肝癌侵袭转移的分子机制的研究.pdfVIP

乙肝病毒X 蛋白促进肝癌侵袭转移的分子机制研究1 1 1 1 1 2 1 欧迪鹏 ，杨连粤 ，陶一明 ，丁翔 ，黄秀英 ，唐发清 1 中南大学湘雅医院肝癌研究室，长沙（410008 ） 2 中南大学湘雅医学院细胞中心，长沙（410008 ） 摘 要：目的研究乙肝病毒X 蛋白在肝细胞癌侵袭转移中的信号传导通路，继而指导肝细 胞癌的临床诊断和治疗。方法 通过对不同类型肝细胞癌手术标本的研究，发现HBx 与基质 金属蛋白酶、整合素的相关性。采用分子生物学方法研究其分子机制，构建稳定表达 HBx 基因的肝癌CCL13 细胞系，从mRNA 、蛋白质和酶活性等水平检测多种基质金属蛋白酶、 整合素的表达差异，并分析癌细胞的侵袭性改变。结果 转染 HBx 基因的肝癌细胞可上调 MT1-MMP 的表达，从而活化MMP-2 ，促进MMP-2 与整合素αvβ3 的结合，使肝癌细胞生 物学行为发生改变，获得侵袭转移潜能。结论 乙肝病毒X 蛋白通过上调MT1-MMP 等级联 反应，促进肝细胞癌的侵袭和转移。 关键词：HBx；真核表达载体；质粒；肝细胞癌；MT1-MMP；侵袭转移 肝细胞癌（HCC ）是我国最常见的恶性肿瘤之一，多发于慢性病毒性肝炎和肝硬化的终 [1] 末期病变，由于较早发生肝内的侵袭和转移导致其预后恶劣 。乙肝病毒X 蛋白（HBx ）常 常是肝脏肿瘤细胞中唯一能检测的HBV 蛋白，其在肝癌侵袭和转移中的作用机制仍不太清 楚[2-4] 。为此，我们在大量临床研究中发现高转移潜能的肝癌手术标本HBx 与MT1-MMP 、 MMP-2 有很强的相关性，进一步的实验研究证实HBx 通过上调MT1-MMP 的途径促进肝细 胞癌的侵袭和转移。 1. 材料和方法 1.1 临床资料 病例资料选自中南大学湘雅医院 1994 年元月－2004 年 12 月住院手术病人的病理标本 和临床资料，我们在前期大量的基础和临床研究中发现孤立性大肝癌（SLHCC ）较结节性 肝癌（NHCC ）有相对较良好的肿瘤生物学行为，即NHCC 有较强的侵袭转移潜能[5,6] 。因 此，为了便于研究，我们将肝癌划分为小肝癌（SHCC ）、孤立性大肝癌（SLHCC ）和结节 [7,8] 。手术标本采用免疫组化检测 MT1-MMP 、MMP-2 性肝癌（NHCC ）三类进行比较分析 和αvβ3 的阳性表达情况。 1.2 质粒构建 480bp 的HBx 片断从全长HBV DNA 质粒pTTHK （由第四军医大学病理教研室郭双平 博士惠赠）中克隆出来，扩增 HBx 基因上游引物为 5’-ATCGGTACCATGGCT GCTAGGCTG-3’ ；下游引物为5’-GGAGAATTCATGATTAGGCGAAGGTG-3’ 。 PCR 反应条件：94°C 40s→63°C 40s→ 72°C 55s ，循环32 次后，72°C 延伸5 min 。 480bp 的HBx 扩增产物插入连接到pcDNA3.1 (Promega)真核表达载体上的EcoR Ⅰ和 Kpn Ⅰ两个 酶切位点上构建表达HBx 的重组质粒pcDNA3.1-HBx 。 1.3 细胞系及稳定转染 人肝CCL13 （Chang Liver ）细胞系购自美国标准物保藏中心（ATCC ）。转染前24 小时， 1本课题得到国家自然科学基金项目），国家“十五”科技攻关项目（2001BA703B04 ）和教 育部高校博士点专项科研基金（20030533037 ）的资助。 -1- 将细胞用胰酶消化、以2×105 细胞/孔在6 孔板（直径35mm ）中接种生长状况良好的CCL13 细胞，于5%CO2 、3