实验十二 聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

实验十二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、目 的 了解聚丙烯酰胺盘状电泳的基本原理和操作技术。 二、原 理 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径可用改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用7.5％聚丙烯酰胺凝胶，分离比较大的分子，如核糖体核酸时则用2.5％凝胶。 凝胶电泳分辨力较高。 三、器 材 1．电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽。 2．电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5－7毫米，长80－100毫米。 3．玻璃架（制胶时用来垂直插放玻璃管）。 4．微量注射器或微量吸管。 5．带长针头的注射器。 6．日光灯。 7．带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管。 四、试剂和材料 1．唾液。 2．贮液和工作溶液：按下页表配制。 五、操作方法 一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。 l. 分离胶的制备 将贮液由冰箱取出等达到室温后再按下表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过硫酸分别放在真空干燥器中。待抽出溶解的空气后取出，赶快混匀，用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段玻璃棒的乳胶管塞住，乳胶管中加二滴40％蔗糖后插在玻璃架上），灌入的分离胶液高约6．5厘米，然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上，距胶面约0.l厘米处沿管壁缓缓加人3－5毫米高的蒸馏水层，切忌使加入之水呈滴状坠入胶液，这样会使顶部凝胶浓度变稀，改变凝胶孔径。 水层放好后，静置胶液使进行聚合反应。正常情况下10分钟开始聚合，应控制在30分钟到1小时内完成聚合。 刚加水时看出有界面，后逐渐消失。等到再看出界面时表明凝胶已经聚合，再静置30分钟便聚合完全。 贮液 100ml溶液中的含量 pH 工作溶液混合比 1 1mol/L 盐酸 48ml 8.9 小孔乳胶（分离胶） 1份1号贮液 2份2号贮液 1份水 4份3号贮液 pH8.9，凝胶浓度7％ Tris 36.6g TEMED 0.23ml 2 Acr 28.0g Bis 0.753g 3 过磷酸铵 0.14g 4 1mol/L 盐酸 48ml 6.7 大孔乳胶（浓缩胶） 1份4号贮液 2份5号贮液 1份6号贮液 4份7号贮液 pH6.7，凝胶浓度2.5％ Tris 5.98g TEMED 0.23ml 5 Acr 10.0g Bis 2.5g 6 核黄素 4.0g 7 蔗糖 40g 电极缓冲液 Tri 6.0g 甘氨酸 28.8g 加水到1 L 8.3 用时稀释10倍 2．浓缩胶的制备 用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液（滤纸不要接触胶面）。 按比例混匀浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，抽完气后再混合），先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的顶部，除去漂洗液后，按上法加人浓缩胶液约0.5－l厘米高，并立即仔细加水层。然后在距管10厘米处用日光灯照射进行光聚合。正常情况下照射6－7分钟就可看到浓缩胶显乳白色，表明聚合开始。继续照半小时，使聚合完全。 除去水层，吸干后用上电极槽缓冲液洗涤，再将这种缓冲液加至管顶，在室温放置0. 5—1小时就可使用。 浓缩胶应在临用前制备。 3．加样 盘状电泳所需样品很少，用1毫克／毫升浓度的样品液每管需5—100微升。 加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去，要注意先拉开乳胶管使空气进人，再拔下来，防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把管固定在上槽的洞中，要保证凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽灌满电极缓冲液。 将4号贮