体外转染hIGF-1基因重组腺病毒载体对家兔椎间盘髓核细胞凋亡影响.pdfVIP

6 安徽省医学会骨科学第十三次学术会议论文汇编 路，一条途径是PI-3激酶激活，进而形成磷酸化磷酸肌醇(phosphoiIlositide 另一条途径是激活细胞外信号调节激酶(ex缸粥ellularregulated si印al killase，圆，即有丝分裂原蛋白 F骶单克隆抗体引起的软骨细胞凋亡，说明IGF．1可以抑制F销途径的细胞凋亡，考虑仍旧是通过调 节Bcl．2家族来抑制凋亡的发生。 本实验中显示IGF-1抑制髓核细胞凋亡，探究其抗凋亡机制可能和纤维环细胞、软骨终板细胞 相类似。在目前所发现的两条凋亡途径中，IGF一1有可能是作用于内源性线粒体、细胞色素C途径， 进一步研究。 体外转染hIGF一1基因重组腺病毒载体对家兔椎问盘髓核细胞凋亡的影响 张长春周建生崔国鹏 (蚌埠医学院第一附属医院骨科) 目的本实验利用肿瘤坏死因子吨(1N阳)诱导培养的家兔椎间盘髓核细胞凋亡，携带hIGF．1基因腺病毒载体转 染进行干预，探讨胰岛素样生长因子I(IGF．1)对髓核细胞凋亡的抑制作用。方法1．从健康家兔取出椎间盘髓核， 用Ⅱ型胶原酶消化法分离原代椎问盘髓核细胞后，单层培养并以胰酶消化法传代，采用差速贴壁法进行纯化。2．构 基因腺病毒载体和n晒吨共同作用)、n晒吨组(仅n晒吨因子作用)进行分组处理。4．利用荧光显微镜观察病毒 载体转染情况，We咖m．b10t检测hIGF．1蛋白，n-PCR技术检测hIGF．1mRNA；利用光学显微镜、原位末端标记 果 表达，而空白组及n晒吨组无表达；rt．PCR检测AdIhIGF．1组有hIGF．1mRNA表达，而空白组及n师一n无hIGF．1 细胞凋亡有抑制作用。 关键词椎间盘退变；下腰痛；髓核细胞；培养；凋亡；胰岛素样生长因子-I；白介素．1；原位末端标记 椎间盘退变的机制较为复杂，目前研究认为椎间盘退变主要表现在细胞和细胞外基质成分的变 化，而后者是椎间盘力学特性丧失的直接原因。椎间盘退变主要包括髓核细胞凋亡、活力下降、细 胞外基质合成和分布的改变，细胞外基质是由髓核细胞合成分泌，因此椎问盘细胞的过度凋亡是引 起椎问盘活力下降的直接原因，退变的椎间盘标本中椎间盘细胞的凋亡率高达53％～73％。 TNF．a是强有力的炎性细胞因子，对中性粒细胞@M№和单核细胞有趋化作用，并使之活化和脱颗 粒，释放炎症介质。有研究证实耵旺．n能使软骨细胞变性死亡，从某种程度上说明TNF-Ⅱ表达越高， 椎间盘细胞退变越快。IGF．1具有许多生物学功能，具有促进DNA合成，糖蛋白合成，氨基多糖的 合成，以及蛋白质的合成，同时它有干扰和抑制F鹤系统作用。IGF．1在胚胎分化中期起重要作用， 可促进有丝分裂，并且其在体外细胞培养试验中具有抑制细胞凋亡的作用。目前对椎间盘退变的研 f；屺tor 究较多，大多围绕IGF．1、转化生长因子p(缸彻sfo衄inggro、硼1 beta，TGF—p)、碱性成纤维细 fibroblaSt 胞生长因子(b鹊ic 安徽省医学会骨科学第十三次学术会议论文汇编 7 人对hIGF．1基因重组腺病毒载体能否抑制n吓．a诱导的髓核细胞凋亡进行研究。胰岛素样生长因 测定，hIGF．1111]5冰A的检测以及原位末端标记技术，来观察hIGF．1基因的抗凋亡作用。 l材料与方法 1．1材料 1．1．1 (天根生物技术(北京)有限公司)，一步法赆PCR试剂盒(天根生物技术(北京)有限公司) 养管理中心。 1．2实验方法 1．2．1椎间盘髓核细胞的获取与分离取健康成年家兔4只，雌雄不限，体重2~2．5kg，无菌条件下 取出腰椎间盘髓核组织剪成l锄3大小，依次用0．25％胰蛋白酶，O．1％II型胶原酶消化，消化液予以 重悬。吸出少量用O．4％台盼兰染色并用细胞计数板计数，调节细胞浓度，按1×10≥缸l的密度接种于 培养板和培养瓶中，培养板预先置有盖玻片，在37℃、5％C02饱和湿度细胞培养箱中培养。之后3～ 4天换液一次，按时倒置显微镜观察拍片，细胞增殖至瓶底80％左右时进行传代，II型胶原免疫组化 染色鉴定细胞表型后，用生长良好的第二代髓核细胞进行凋