分子生物学实验报告.docVIP

PCR基因扩增 实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2倍。 实验仪器：基因扩增仪 移液器 实验试剂： 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4种dNTP Taq酶 DNA模板 两种引物（正向引物和反向引物） 实验步骤:` 1、按顺序向微量离心管中依次加入： ddH2O 20μl DNA 样品5μl 10×PCR 缓冲液5μl dNTP 4μl 引物I 5μl 引物Ⅱ 5μl 混匀。 2、PCR反应参数 (1) 94℃变性2min (2) 94℃变性30sec， (3) 66℃退火30sec， (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)40次 （6）72 ℃延伸7min。 （7）4℃保存 3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。 实验结果：照片结果图 1.10ul样品 2.样品 3.DNA相对分子质量标准 4.对照 DNA琼脂糖凝胶电泳 实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。 实验仪器：1. 电泳仪；2. 紫外检测仪；3. 水平电泳槽；4. 移液枪；5. 一次性手套。 实验试剂： 配置1000ml 5 x TBE pH8.0 Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml 2、EB溶液 溴化乙锭溶液（0.5ug/ml） 3、凝胶加样缓冲液（6 x ） 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 4、 琼脂糖 实验步骤： 1、琼脂糖凝胶的制备： （1）称取琼脂糖0.3g，加入30ml 0.5 x TBE缓冲液，在微波炉上加热溶解，取出摇匀，配制成1％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液数滴。 （2）取有机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将机玻璃内槽两端密封，将有机玻璃内槽放置一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。 （3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。 （4）加入电泳缓冲液至电泳槽中。 2、加样 用移液枪取缓冲液，依次点1—2ul缓冲液在一次性手套上。再取样品溶液5ul左右，加入缓冲液中，混匀后，将溶液加到样品孔中，并记录好点样顺序。同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。 3、电泳： 加入pH8.0Tris－硼酸－EDTA缓冲液后，接通电泳槽与电泳仪的电源，最高电压不超过5V /cm，电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。 染色及观察： 电泳完毕，取出凝胶模具，将其浸入溴化乙锭染色液中，染色15min后将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm、 300nm或360nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现桔红色荧光条带，照相。 实验结果 上图为质粒DNA和酶切产物的电泳结果 DNA重组 实验目的 通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。 实验原理：外源 DNA 片段和线状质粒载体的连接就是DNA重组，在Mg2+和ATP存在下， DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。在这种情况下产生的两个杂交体分子带 有 2 个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的 5磷酸和 3羟基间磷酸二酯 键的形成可在体外由两种不同的 DNA 连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 噬菌体 DNA 连接酶。受体细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状