1-细胞生物学实验技术.pptVIP

检测系统 激光扫描共聚焦显微镜为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有3个荧光通道和1个透射光通道，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。每个PMT前设置单独的针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。通过在线视频打印机或数字照相机可以实时拷贝图像和制作幻灯。 计算机系统 激光扫描共聚焦显微镜的各个部分由计算机设置和控制，共焦图像文件大，每幅单色图像要256kb以上，而且每次采集图像一般需要将几幅甚至上百幅图像作为一个文件存储，因此对计算机软件功能、运行速度，内存、硬盘要求很高。 * * （1）材料：培养的人宫颈癌HeLa细胞(细胞系)，盖玻片(厚度在0.13~0.17mm)； （2）试剂：PBS，4%多聚甲醛，TPBS，一抗分别为兔抗-肌动蛋白多克隆抗体、鼠抗-微管蛋白单克隆抗体，二抗分别为FITC标记抗兔Ig-G、TRITC标记抗鼠Ig-G。 （3）设备：激光扫描共聚焦显微镜。 * * 三、实验用品 * * 1、接通总稳压器电源开关。 荧光显微镜：先接通透射光源(卤素灯)，调节灯电流使之适应观察样品；再接通汞稳压电源。开启汞灯后，必须使其工作1h再关闭，并需等其冷却15~20min后方可再次启动，尽量减少开关次数以延长汞灯寿命。 激光器部分：检测各激光器的功率调节旋钮，使之处于最小；开启所要使用激光器的相应冷却系统；接通激光器电源，此时激光管开始工作。用激光管功率调节旋钮可调节激光管输出功率的大小。 四、实验操作 * * 2、开启扫描器电源。 3、打开计算机显示器及主机开关，进入操作系统。 4、实验观察。将洁净的盖玻片预置于培养皿中，待HeLa细胞贴壁良好后取出，4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗，分别经水化、TPBS透化细胞、5%牛血清白蛋白封闭后，加入兔抗-肌动蛋白多克隆抗体、鼠抗-微管蛋白单克隆抗体(1:100稀释)的一抗，室温孵育2h，TPBS洗3次，加入FITC标记抗兔Ig-G、TRITC标记抗鼠Ig-G的二抗，室温孵育1h，TPBS洗3次，甘油封片后立即进行激光扫描共聚焦显微镜观察。 5、关机时顺序关闭各电源：关闭汞灯电源，将激光输出功率调至最小，关闭激光器电源，关闭计算机，关闭扫描器电源，关闭总稳压电源。 * * 五、注意事项 1、尽量减少开关机次数，降低激光光源的消耗，若中途停止测定的时间在3h以内，将激光功率调节到最小或等待状态，这种低功率运行状态能够减少激光光源的消耗； 2、一般开机或改变激光功率后，约需20min激光光源才能达到稳定； 3、在同时使用2种或2种以上荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉、荧光强度匹配的探针； 4、对组织切片标本，首先注意切片的厚度；由于组织切片在固定的过程中会带入干扰荧光，所以需注意组织样品固定剂的选择。 * * 5、对细胞标本要注意细胞种类、纯度、密度及细胞形态的选择； 6、对于易猝灭的荧光样品，不要对同一样品进行多次测量，否则激光照射可引起不同程度的荧光猝灭，改变荧光强度而带来实验误差； 7、 激光扫描共聚焦显微镜要远离电磁辐射源，环境无振动，注意室内保持无尘，因为灰尘可影响光路系统和成像质量。 * * The end… * * * (3)转动转换器，使相差物镜(20×)对准标本，同时转动环状光阑转盘选用20×标示孔的光阑，以使环状光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，用细调节器调节焦距，使物像清楚。 (4)合轴调节。将合轴望远镜换入目镜筒内，一边向望远镜内观察，一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，将望远镜固定，升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后前后左右调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。 * * 五、注意事项 1、载玻片或培养瓶必须平整、均匀，标本不能太厚，否则相差显微镜成像效果不好； 2、标本要在有水的环境中（如培养液或用水封片）成像效果才明显。 六、实验结果与分析 在倒置相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的内部结构，细胞边界、细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构清晰可见，分裂期细胞可见期染色体。 第三节 荧光显微镜的构造及使用方法 * * 一、原理与应用 * 1、荧光的产生 一些化学物质经短波高能光激发后能吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以荧光的形式发射。荧光发射的特点是在接受能量后即刻引起发光，而一旦停止供能荧光现象随之瞬间消失。各种荧光分子有其特定的吸收光谱；光谱(荧光光谱)，即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发