第八章 植物细胞培养.pptVIP

第六章 植物细胞培养及次生代谢产物生产 主要内容 单细胞培养(重点） 悬浮培养 大规模培养 次生代谢产物生产（重点） 前言 植物是很多工业、生物用品的原料。 食品/医药： 化妆品： 纺织业： 据保守的估计，目前已发现的 植物天然代谢物已超过2万种 前言 鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。 早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。 前言 早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。 Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。 前言 细胞培养提取产物的优势： 提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。 植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量。 培养周期短，有利于节约成本大规模生产。 我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。 前言 细胞大规模培养提取次生产物的技术路线： 制备种子细胞（单细胞培养技术） 种子细胞放大培养（摇瓶）（悬浮培养技术） 大规模培养（生物反应器） 第一节 单细胞培养 单细胞的分离 从完整的植物器官中分离 从组织培养物中分离 单细胞的培养 平板培养 看护培养 微室培养 饲养层培养 一、单细胞的分离 1. 从完整植物器官中分离单细胞 该分离方法分离体系中含杂质多，纯化操作麻烦。 （1）、机械法：适用于薄壁组织细胞排列疏松的植物常采用叶肉细胞 1965年，Ball由花生叶片得到离体细胞并在培养基中培养成功。 目前在薯、大豆、石刁柏等植物中都成功分离出有活性的叶肉细胞。 操作时一般先用镊子撕掉表皮，再用解剖刀把叶肉细胞刮下来。 （2）、酶解法：用果胶酶处理。 1968年Takebe用此法分离烟草叶肉细胞获得有活性的单细胞。 一、单细胞的分离 2. 从组织培养物中分离单细胞 最常用的为愈伤组织，要求愈伤组织的疏松性好、增殖旺盛，因此在分离前需进行愈伤组织的选择和继代。 操作：2g愈伤 50ml液体培养基 25℃、黑暗、振荡培养 10d左右更换4/5新鲜培养基（同时去掉上层细胞碎片和衰败细胞） 重复几周期得单细胞悬浮液（此时培养液由浊变澄清） 二、单细胞培养 常用的培养方法有： 平板培养法 微室培养法 看护培养法 双层滤纸植板培养 细胞培养按培养方式分： 固体培养、液体培养、双相培养（培养基状态） 悬浮培养和固定化培养 （培养中细胞的状态） 二、单细胞培养 1. 平板培养法 操作：悬浮细胞 过滤去掉大的细胞团 调整密度为 5×105 1份悬浮液与4份35℃固体培养基混合 倒平板（1~2mm） 做细胞位置标记 25℃暗培养 3周后形成愈伤组织 效果检测：植板率 = 长出细胞团的单细胞数/接种的总细胞数 影响植板率的因素：细胞密度、培养基成分 二、单细胞培养 2. 微室培养法 1960年 Jones 设计 在培养过程中可以进行连续观察。 烟草获得开花植株。 二、单细胞培养 看护培养法： 二、单细胞培养 4. 双层滤纸植板培养 平板培养和饲养层培养相结合 克服了细胞在液体培养基中的流动性，方便转移克隆细胞团 三、种子细胞筛选 种子细胞的制备应用单细胞培养技术。 筛选时将单细胞形成的愈伤取一半进行成分分析，另一般保留培养。 为提高次生代谢物产量，培养中往往结合诱变及压力筛选。 例：由红豆杉生产紫杉醇时，在愈伤诱导培养基中添加紫杉醇的前体物质L-苯丙氨酸。梅兴国（2001）在培养基中添加1.6m mol/L的L-Phe得到了含量为正常细胞5倍的突变细胞系。 第二节 悬浮培养 种子细胞的获得通过愈伤增殖和悬浮培养。 一、悬浮培养法：在液体培养基中增殖单细胞或小细胞团的技术。 材料：高产细胞系的愈伤组织。 操作：转移愈伤至液体培养基（1：10）