微卫星引物筛选步骤.docVIP

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2015-07-23 发布于安徽
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微卫星引物筛选步骤.doc

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1．进行酶切用VspⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。反应体系为：ddH2O 15μL VspⅠbuffer 2μL VspⅠ酶 1μL DNA 2μL 总体积 20μL酶切在37PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）VspⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 5’T A A T↑T A AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC A2：5’TAG GTA CGC AGT C AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 2．接头制备用10μL A1（200μM）和10μL A2（200μM）混合，94℃3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下： ddH2O 5μL T4 ligation酶 0.5μL T4 buffer 4μL 酶切产物 20μL ATP（10mM） 0.3μL AE 1μL总体积 30.8μL 上述混合体系在16℃4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下： ddH2O 14μL 10×buffer 2.5μL Mg2＋ 2μL dNTPs（10mM） 0.5μL A3 1μL DNA（连接产物） 5μLTaqE（2.5U/μL） 0.2μL总体积 25.2μL PCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，5.检测扩增产物扩增产物大小应在750bp左右，即400～1000bp较好。6．回收扩增产物将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中↓向其中加入1/10总体积预冷的3M NaAC和2倍体积预冷的无水乙醇（或者等体积预冷的4MNH4AC↓－20℃放置30min（该步可在－20℃↓ 室温，12000rpm离心10min↓弃上清，加入1ml左右70％乙醇洗涤一次↓ 室温，12000rpm离心5min↓弃上清，干燥后加入20μLddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）7．配杂交体系取250～500ng回收DNA与50～80pmol bio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分别为4.2×SSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下：ddH2O 74.5μL 20×SCC 21μL 10%SDS 0.7μL 回收产物 3μL bio-SSR探针（AC）15 0.8μL 总体积 100μLPCR反应程序为：95℃ 5min，在58bio-SSR探针序列可以为（AC）10、（AC）15、（AC）12或者AG重复均可，这个可以根据基因组序列确定。8．磁珠准备1）2mg beads（200μL）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100～200μL之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力