HLA测序分型方法及其在造血干细胞移植中的应用.pdfVIP

维普资讯 · 258 · 中国输血杂志 2007年6月第 2O卷第 3期 ChinJBloodTrans[usion，June，2007，Vo[．2O，No．3 · 综 述 · HLA测序分型方法及其在造血干细胞移植 中的应用 罗玫 郑忠伟 陈强(中国医学科学院 中国协和医科大学 输血研究所，四川成都 610081) 关键词 ：PCR—SBT；HLA分型；克隆测序 ；造血干细胞移植 中图分类号：R457．1 1 Q785 文献标识码 ：A 文章编号：1004-549X(2007)03—0258—03 HLA基因位于人类第 6号染色体短臂 6p21．3区域， 等位基因的PCR-SBT技术；随后 Santamaria等Ⅲ阐述了对 由一系列紧密连锁的基因座组成，具有高度的多态性，是迄 Ⅱ类等位基因作 eDNA测序的方法，但由于测序引物设计在 今为止所知的人类最复杂的遗传系统。截止 2007年 4月， 外显子区域，随需要测序的等位基因不同。测序引物的设计 被WHO正式命名的 HLA—I类等位基因数为 1839个， 要随之改变，且不能扩增出Ⅱ类等位基因完整的外显子 2， HLA一Ⅱ类等位基 因数为 875个，2者合计 2714个[。 无法鉴定只在 5或者 3端有差异的等位基 因。1999年， HLA基因编码的蛋 白质主要功能是参与免疫应答 中的抗原 Kotseh等[5针对较为保守的内含子设计测序 引物 ，不仅弥 呈递，在造血干细胞移植中供受者间HLA不相合则能够导 补了上述缺陷，也使测序引物成为通用．大大减少了测序所 致机体对移植物的排斥反应或移植物抗宿主病 (GVHD)的 需引物，测序分型方法得到进一步发展。Santamaria等[6于 发生。近 2年研究发现，HLA低分辨水平相合的供受者间， 1993年率先报道了对多态性更为丰富和复杂的 HL I类 仍有部分发生较强的免疫排斥反应而影响移植预后，因此建 等位基因的测序方法，之后 Cereb等[7对此加以改进，通过 立准确的HLA高分辨分型技术无论在HLA的基础研究还 座位特异性扩增获得基因组 DNA序列，并针对 内含子 1和 是临床应用上都有重要意义。HLA抗原分型传统上采用的 3设计引物，提高了测序引物的通用性，被后来多数学者采 是血清学方法 ，即微量淋 巴细胞毒试验 ，由于特异性抗体来 纳 。不 同的PCR—SBT方法有不 同的PCR扩增策略，一般将 源的限制 以及存在交叉反应等干扰，其分型结果存在一定的 PCR-SBT分成 2大类： 误差，如 HLA—B纯合子分型误差高达 25 [，目前 以DNA 1．1 一般测序分型 是将某 1个 HLA座位上的2个等位 为基础的HLA基因分型方法已取而代之。近年来实验室 基 因同时扩增 ，所得 PCR产物包括 2个等位基 因的基因片 常用 的方法有 3种 ：1)PCR—SSP分型．主要应用于临床少量 段，然后直接以PCR产物为模板测序，获得序列后与数据库 样本或零散样本 的HLA分型；2)PCR—SSO分型，因其高通 比对来作 HLA分型，目前已有一般测序分型的商品化试剂 量的特点而为各地骨髓库广泛采用；3)测序分型，与前 2种 盒推 出。一般测序分型方法操作较为简单 ，但测序反应前未 方法相 比，其优势是直接获得 DNA序列，可 以鉴定所有存 将 2个等位基 因分开，在某些条件下，不能确定顺反式连锁 在 的多态性，为最直观、最准确 的方法 。近年来 ，由于 自动测 而产生模棱两可的结果，部分商家因此提供了不同的解决方 序仪的出现，测序反应的许多步骤得 以自动化，测序分型方 案，如 Atria测序分型试剂盒 ．针对 HLA—A、B位点出现的不 法逐渐被HLA分型实验室接受。用于 HLA分型的测序方 确定结果，设计了组特异性引物来解决这类常见的问题；针 法有 2种：直接测序和克隆测序，前者包括一般测序和组特 对DRB位点出现 的模棱两可，Amersham等试剂盒设计有 异性测序，后者则包括基因组 DNA克隆测序和 eDNA克隆 86位密码子测序引物