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浅析自噬在动物神经干细中的增殖和分化 关键词：自噬神经干细胞 轴突延伸 增殖 分化 第一章 文献综述细胞的研究进展 1.1 神经干细胞的研究进展 研究发现，神经干细胞分布在哺乳动物大脑的特殊区域，比如室管膜下 区（The Subventricular Zone, SVZ）、海马区( Hippocampus, HP )等 等，这些细胞都具有一致的生物学特性，就是不断分裂增殖、多分化潜 能的特性，它们在不同的诱导条件下可以分化为神经元、星型胶质细胞 和突触胶质细胞。随着神经干细胞研究的深入，研究者发现，内源性或 外源性神经干细胞可能成为神经损伤及神经退行性疾病治疗的一种崭 新的治疗手段。但在许多疾病状态下，由于神经干细胞生存微环境的改 变，导致神经干细胞之间的信号通路发生改变，这不但影响了神经干细 胞分化的可塑性，甚至还可能影响其存活性。 1.2 自噬研究进展 通常，在细胞内部错误折叠蛋白及大量冗余的蛋白质主要通过两种方式 进行降解：一种是泛素-蛋白酶体系统，也就是说细胞内的蛋白通过内 质网大量积聚后引起细胞内质网应激，从而激活泛素蛋白酶体途径将多 余的细胞通过蛋白酶体途径消化降解；而另外一种是自噬-溶酶体介导 的细胞自噬(autophagy)途径。自噬 （Autophagy），广泛存在于真核细 胞中，是一种基本的生命现象；最早是在 1962 年由学者 Ashford 和 Porter 在研究细胞功能时发现细胞存在“自己吃自己”的现象后而提出 的。通常所指的细胞自噬是指细胞内部通过自噬途径降解细胞内的多余 的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，从而清除细胞内的垃 圾并维持细胞内环境的稳定，达到细胞稳定的过程[43]。 目前，研究者主要利用几种自噬标志性蛋白作为判断自噬发生活化的标 志。LC3及 p62 蛋白在细胞质内发生点状积聚说明自噬的发生，是判断 自噬活化公认的金标准。蛋白酶体降解和自噬是处理蛋白的两个主要机 制。与蛋白酶体不同的是，自噬能降解可溶和聚集的蛋白。因此，在自 噬过程中，胞浆蛋白-包括细胞器和其他成分-由双层膜包裹形成自噬体。 这些囊泡的成熟包括他们与溶酶体的融合，导致自噬体内容物被溶酶体 酶降解。一系列的应激信号，如营养剥夺或用不同抗癌剂（包括诱导 ER应激）刺激自噬过程发生-这被认为是细胞必要的反应，参与细胞内 一些生理功能。 自噬在细胞内的发生速率是很低的，因此只有在特定的条件下才被激 活。暴露细胞于自噬触发刺激下，启动一系列自噬结构的形成使 IM 出 现并延伸。哺乳动物细胞内 IM确切的来源还不清楚，尽管已被证实可 能是新合成的脂类或由 ER、Golgi 或内体芽生的小泡。跨膜蛋白 Atg8 和 VMP-1 对于自噬体的形成是必须的，他们在转运脂类到 IM发挥重要 作用，同时募集其它蛋白参与自噬的启动。因此，Atg8 从顺式高尔基 转位到自噬起始点似乎是自噬起始阶段的关键事件。 …………………… 第二章 实验部分23 2.1 大鼠神经干细胞的分离与培23 2.1.1 前言23 2.1.2 材料和方法 24 2.1.3 实验结果 34 2.1.4 讨论40 2.1.5 小结42 2.2 自噬对大鼠神经干细胞增42 2.2.1 前言42 2.2.2 材料和方法 44 2.2.3 实验结果 50 2.2.4 讨论60 2.2.5 小结62 第三章 结 论63 …………………… 第二章 实验部分 2.1 大鼠神经干细胞的分离与培养 神经干细胞 （NeuralStem Cells, NSCs）的研究已成为热点，其研究为 治疗一些神经退行性疾病和神经系统损伤性疾病带来了希望，为中枢神 经系统（Central Nervous System, CNS）的重建和神经再生提供了一 条新的途径。神经干细胞研究之所以能成为研究热点之一，源于其重要 的发育机制和潜在的临床应用价值。 虽然神经干细胞的来源有所不同，但是目前关于神经干细胞的分离、培 养的技术已经相对成熟，不同实验室虽然培养方法略有不同，但是整体 上没有太大分别。目前，一般的实验室利用悬浮培养法在无血清的培养 基中分离培养神经干细胞，由于非神经干细胞在这种缺少血清的培养系 统中缺乏营养而无法存活，最终只有能够适应无血清培养基的神经干细 胞能够存活，并且在生长因子的作用下，这些神经干细胞可以进行生长 增殖。在这种条件下培养，神经干细胞逐渐形成聚集生长在一起的神经 球，经过标志性蛋白染色及 Western Blot 结果显示，神经球中的多数 细胞具备神经干细胞特征。利用胰酶消化、破碎，将成团生长的