什么是同步培养.docVIP

同步培养指使细胞的分裂周期为同步的培养方法。同步化方法的原理是在使所有细胞都处于大体相同的分裂周期的处理后，才使增殖同时开始进行。最稳妥的操作方法是对细胞的大小等先作出一个标准，将大体同一时期的细胞选出并集中起来。另外，是采用从培养基中除去生长发育所必需的营养源、温度处理、或加药剂等方法，抑制先发育的细胞的发育，待到晚发育的细胞发育以后，解除上述处理，使增殖再一齐开始。常用的人工同步化法分为诱导同步化,选择同步化或两者结合.1):诱导同步化法:a.胸腺嘧啶阻断技术,先高浓度胸腺嘧啶培养细胞，使细胞不能通过S期,再改变其浓度，解除抑制,所有细胞都开始DNA合成，即获得同步化细胞.b.中期阻断法,常用秋水仙素来抑制微管聚合,将细胞阻断在有丝分裂中期.此法不常用.2)选择同步化法:a有丝分裂选择法,这种方法主要是根据细胞周期的不同阶段的生理变化设计的方法.主要特点是可以获得一定数量的M期的同步化细胞，不受药物影响,同步化高，但获得细胞数量少，步骤多，且只能是在贴壁细胞中可以用.b 细胞沉降分离法,主要用于悬浮细胞，其理论依据是细胞周期不同阶段的细胞体积不同.因为细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径的平方成正比. 1．振荡收集法 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放4~E冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。 2．秋水仙胺阻抑法 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 (2)加入秋水仙胺，使最终浓度为0．05—0．1μg／mL培养基，作用6—7 h。如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍。 (3)荡收集细胞，800 r／min离心5—10 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。 加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。由于秋水仙素或秋水仙胺对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。 3．N2阻断法 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 (2)将培养瓶置于N20罐中通人适量CO2(约相当于罐中体积的5％)。 (3)关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅／英寸2为止。 (4)将N2装置放在37℃培养箱中10—16 h(通常过夜)。次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出(最好放出窗外)。 (5)取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。 (6)800 r／min离心10 min收集细胞。 (二)S期同步化方法 　　胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：该法利用过量TdR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法，即双阻断法。第1次阻断时间相当于G2、M和G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1／S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次，再释放。现以HeLa细胞为例加以说明(HeLa细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h)。 1．将细胞培养至指数生长期的早期。 2．加入含2 mmol／L TdR的培养基(2—2．5 mmol／L用于肿瘤细胞的同步化培养，而CHO细胞则用7 mmol／L TdR)，作用16 h。 3．弃掉TdR培养基，用Hanks液洗2—3次，再换上新鲜培养基继续温浴9 h。 4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。 5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次TdR释放0 h时取样则细胞处于G1／S期交界处；如2-7 h取样则为不同阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。 (三)G1期和G2期细胞的获得 1．G2期细胞的获得 根据细胞周期测定的数值，采用TdR双阻断法使细胞同步在G1／S期交界处后，洗去TdR使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。 2．G1期细胞的获得 (1)将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养1－10 h即可获得各阶段的G1期细胞。 (2)用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得中G1期细胞。 (四)G0期细胞的获得 可采用血清饥饿法得到G0期细胞： 1．取处于对数生