免疫组化1-概论抗原抗体.pptVIP

免 疫 组 化 Immunohistochemistry 学习本章节的总体要求 *1. 熟悉免疫组织化学技术特点及其原理 *2.掌握免疫组织化学染色的操作流 程 *3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制 4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.了解单克隆抗体制备原理和步骤 概 论 一、什么是免疫组织化学 免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行定性、定位、定量研究的一门科学。 这项技术本质上是一种染色及原 位示踪技术，它是在酶组织化学基础 上发展起来的，始于20世纪中期。 免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。 1.特异性强 专一 2.敏感性高 检测阈值达ng或pg水平 3.定位准确 既可定性、定位，又可定量 4.三位一体 形态、功能和代谢三结合 缺点：干扰多，易出现假阳性 ?（一）?组织处理与切片选择 （二）免疫染色的前处理 试剂准备（示踪，放大，标记） 消化 阻断 *（三）免疫组化染色 原理、优缺点、流程 （四）免疫染色的后处理 增强、衬染、封固 *（五）结果判断与对照设置 方法众多 敏感不同 程序雷同 按需选用 一、抗原： 凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（反应原性）的物质。 半抗原＋载体蛋白 全抗原 载体蛋白：BSA 、 多聚赖氨酸 、 牛甲状腺球蛋白等； （免疫原性强，易获得，交叉反应易去除） 交联要求：不改变半抗原的分子构型； 远离半抗原的抗原决定簇； 高结合率（结合半抗原数目至少20个以上） 抗原决定簇(表位)：抗原分子中决 定抗原特异性的活性化学基团，其性 质、数量、空间构型决定抗原的特异性。 ---免疫组化的精确性、特异性 二、抗体 B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 ---可与相应抗原特异性结合 ---亦可作为抗原，激发免疫应答 3 .两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈“Y”字构型。 4.重链上结合有不同量的糖,故Ig属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即 μ链，γ 链， α链，δ链和ε链， 由它们组成的Ig分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和IgD。 三、抗体的制备 （一）?? 抗原提取与纯化的一般原则 1.建立检测方法（定性、定量、活性） 2.选择抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品为原料 ---人AFP……AFP(+)肝癌病人腹水；4～6月胎儿血清 ---鼠AFP……孕18天大鼠羊水 ---波形蛋白（vimentin）……猪、牛眼晶状体 ---角蛋白（keratin）……角化上皮 ---肌红蛋白（myoglobin）……骨骼肌 ---胶原（collagen）……皮肤、肌腱等 3.保持抗原分子的稳定性 ----低温、适度pH与离子强度、抑制酶解、保护巯基 4.操作步骤简易、有效。 ---提取 ---分离纯化 ---浓缩 ---贮存 ?（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb的 制备程序 多克隆抗体---指由不同克隆B细胞产生的抗体混合物。 ---每种抗原有多个表位 ---用其免疫动物会产生针对各表位的不同抗体（多克隆抗体） ---血清中的抗体皆是多克隆的 优点：制备简便、价格低廉、抗体效价高 缺点：特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定 ?（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb的 制备程序 1．? 抗原纯化………免疫原