MBP+对小鼠生殖器官的氧化损伤的研究.pdfVIP

[6 ] PAEs 的生殖干扰作用已引起毒理学界甚至普通人群的关注。Janet 等 研究BBP 可以使睾丸重量减轻， 产生病理改变：睾丸曲细精管和各级生精细胞产生萎缩,变性,各级生精细胞减少或消失。流行病学研究表 [7] 明，尿液中MBP 浓度与精液质量改变呈现明显的相关性 。虽然到目前为此，此类研究还比较少，但是已 经足以给我们这样的提示:越来越多的男性生殖障碍可能与PAEs 暴露有关。 本研究的目的在于确定MBP 的角色，在DBP 的致畸性环境中，MBP 是否为一个潜在的毒物，在对 邻苯二甲酸酯的研究中提供更好的理解和发展。本研究以灌胃的方式对小鼠进行了不同剂量的MBP 染毒， 并测定了小鼠睾丸组织活性氧ROS,丙二醛MDA 和还原型谷胱甘肽GSH 的含量，从组织学和分子生物学 领域研究MBP 的生殖毒性，旨在考察MBP 所导致的睾丸组织氧化应激水平的变化和睾丸组织的氧化损伤， 探讨MBP 的生殖毒性的机理。 1.材料与方法 1.1 实验动物 8 周龄雄性Bab/c 小白鼠 （由湖北省疾病预防与控制中心实验动物饲养所提供）。 1.2 实验药剂 邻苯二甲酸单丁酯(Mono-n-butyl phthalate ，MBP) 1.3 实验仪器 F-4500 型荧光分光亮度计（Hatachi 公司）；5415R 低温冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司），DNM-9602 酶标分析仪，FLx 800 荧光酶标仪 （美国 Bio-Tek 仪器有限公司）。 1.4 实验方法 1.4.1 实验动物染毒方法 选用性成熟(7 周龄) 的雄性Bab/c 小白鼠20 只，体重22~28g，随机分成4 个染毒组、一个空白对照组 和一个染毒溶剂组，每组6 只。用金龙鱼食用调和油配制成四个不同浓度（分别为25 、50、100、200mg/kg ） 的MBP 溶液，每天按0.005ml/10g 体重空腹灌胃一次，对照组以等体积的金龙鱼调和油同时进行灌胃，连 续14 天，于第14 天染毒后24h 采用颈椎脱臼法处死动物。 1.4.2 匀浆液的制备 处死动物后，取双侧睾丸，先用冰冷的生理盐水进行漂洗，称取适量的睾丸组织标本，再用PBS 冲洗 干净，加入10 倍的PBS，制成质量分数为 10%的睾丸组织匀浆混悬液，于 10000g/min 离心 15min，取上 清液，备用，分别测ROS 、MDA 及GSH 。 1.4 睾丸组织病理学观察 小鼠颈椎脱臼法处死后迅速取出一侧睾丸, 固定于10% 甲醛溶液中, 常规脱水, 石腊包埋切片, HE 染色, 在光镜下观察组织病理学变化。 1.5 活性氧 （ROS）含量的测定 取小鼠睾丸匀浆上清液，100 倍稀释后，取100μL 加入酶标板，再加入100μL 荧光染料，空白组用 100μLPBS 加100μL 荧光染料。在37℃条件下，避光10min，测485nm，528nm 的OD 值，最终测定活性 氧的含量。 558 1.6 丙二醛 （MDA ）含量的测定 取0.5mL 细胞匀浆上清于10mL 小管中，加入2mL 0.6%TBA 沸水水浴15min 后显红色，冷水冷却后 取1mL，10000rpm/min，离心10min，取上清200μL 于酶标板中测其在450nm，532nm，600nm 的吸光值， 按照公式C=6.45 （D532-D600 ）-0.56D450 (μmol/L) ，计算出丙二醛的含量。 1.7 还原性谷胱甘肽 （GSH）含量测定 取小鼠睾丸匀浆上清200μL，加入有机溶剂1mL/每管 （有机溶剂为V 氯仿：V 正丁醇=4:1 ）涡旋混匀，然 后在冰上静止10min 后10000rpm/min 离心5min，在不破坏蛋白层的情况下取上清液50μL 加入酶标板， 加150μL 浓度为60ng/mL 的DTNB ，空白组用50mL PBS 加150μL DTNB ，室温下避光5min，测其在412nm 的OD 值。 1.8 实验数据处理 所有数据采用origin6.1 统计软件进行方差分析,应用t 检验分析染毒组与对照组的测量值的差异，p ＜ 0.05