RNAi抑制HIF-1α表达对胃癌BGC-823细胞株上皮间质转化现象的影响.pdfVIP

的DMEM培养基常规培养和传代。按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行 空白对照组不加质 转染。阳性对照组在培养液中加入终浓度为200umol／Lcocl2， 粒，空质粒组使用空质粒。 1．2．2 Q RT—PCR检测细胞中HIF一1mRNA的表达：提取培养细胞总RNA，逆转录合 Q 成HIF—lcDNA第一链，PCR扩增30个循环，眦F一1Q引物序列：上游： in引物序列： 凝胶电泳鉴定PCR产物。 1．2．3细胞免疫荧光：转染细胞培养24小时后取出，PBS冲洗后用95％的乙醇固定30 分钟，按照说明书行细胞免疫荧光染色。 1．2．4统计学处理：应用SPSS13．O统计软件。组内比较采用单因素方差分析，组 间比较用LSD法检测各组与对照组之间差异。P≤0．05为差异有统计学意义。 2．结果 2．1psilencer3．卜HIF一1Q干扰重组体对HIF一1Q表达的抑制作用 Pro—P1us 经过R卜PCR后，应用凝胶成像仪成像，经软件Image 6．0显微 图像分析系统分析，采用相对表达量来半定量mRNA的表达。结果显示：与空白对 Q干扰重组质粒可以明显抑制HIF—l 照组和空质粒组相比，psilencer3．卜HIF—l Q Q Q HIF一1mRNA表达没有明显变化。以上结果说明psilencer3．卜H工卜lS1．RNA ： 重组体构建成功，并且可以用于后续试验。(图1) 2．2细胞免疫荧光法检测干扰前后HIF一1Q、E—cad、N—cad的表达 Q表达对胃癌细胞BGC一823上皮间质转化的影响，我们 为了说明干扰HIF一1 蛋白表达的变化。分组同前。结果发现：阳性对照组相对于空白对照组和空质粒 组，其E—cad蛋白表达明显受到抑制，而Twist、N—cad蛋白的表达则显著升高； 空白对照组和空质粒组三种蛋白表达变化无明显差别。干扰组中Twist、N—cad 表达量相对降低，而E—cad表达则明显升高。(图2—5) 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，其死 亡率占恶性肿瘤死亡率的百分之二十以上【4】。虽然肿瘤治疗措施已取得长足进步， 但由于胃癌容易通过淋巴道和血道转移至局部淋巴结和肝、骨和胰腺等器官，疗效 均不甚理想。近年来，分子生物学理论和技术飞速发展，为基因技术在肿瘤治疗的 应用方面开辟了广阔的前景，分子生物学已经成为人类彻底治愈肿瘤最有希望的手 段之一，在抗肿瘤治疗方面，RNA干扰技术有望成为潜在的突破口【s】。本实验利用 psilencer3．1质粒，根据Genbank中报道的HIF-1Q(NMool530)基因核苷酸序列， Q 参考siRNA设计原则设计合成了psilencer3．卜HIF一1siRNA表达重组体。实验 结果表明与空白对照组和空质粒组相比，psilencer3．卜HIF一1Q干扰重组质粒可 Q 以明显抑制HIF一1 Q 组和空质粒组其HI卜1mRNA表达没有明显变化。 上皮间质转化现象指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转分 志物表达上调。在多数实体肿瘤中，EMT现象与肿瘤的浸润转移密切相关。Hif一1 Q是EMT过程中的重要的调控因子。HIF一1Q可以通过wnt、Akt等信号转导途径， 诱导肿瘤纽胞发生上皮间质转化现象。Hif一1是由Hif一1Q和Hif一1 B亚单位组