苓桂术甘汤对脾阳虚泄泻大鼠肠道水通道蛋白4+表达的影响.pdfVIP

decoction.Conclusion on increasingAQP4 leen-yang deficiency. Key words:linggui zhugan decoction; spleen-yang deficiency;diarrhea; AQP4 苓桂术甘汤由茯苓、桂枝、白术、甘草组成，具有温阳化饮、健 脾利水的功效，是 《金匮要略》中温阳化饮法的代表方之一，广泛用 于临床，治疗脾胃阳虚水饮内停引起的泄泻等多种疾病，疗效确切。 我们拟通过对大鼠肠道水通道蛋白4（AQP4）的分析，探讨苓桂术甘 汤治疗脾阳虚泄泻的作用机制。 1材料与方法 1.1实验药物及制备 中药饮片 （茯苓、桂枝、白术、甘草）购于福 州市康福堂大药房。① 番泻叶水煎剂的制备：番泻叶加入适量自来 水浸泡1 h，急火煮沸5 min，继续浸泡2 h后，取得滤液，然后浓缩 成100 %水煎剂，即1 ml药液中含1 g生药，4℃冰箱保存备用。② 苓 桂术甘汤煎剂的制备：按新世纪全国高等中医药院校规划教材《金匮 要略》（2003年第1版），苓桂术甘汤药物组成及比例为：茯苓 ∶ 桂枝 ∶白术∶甘草=4∶3∶3∶2。将生药加自来水浸泡1 h，煎煮30 min过滤，药渣再加自来水煎煮20 min，过滤，合并2次药液，在80℃ 恒温浴条件下，浓缩成100 %水煎液，4℃冰箱保存备用。 1.2主要试剂和仪器 ① 试剂：羊抗大鼠AQP4的多克隆抗体、DAB 显色试剂 （武汉博士德生物公司）。② 主要仪器：TP1020生物组 织自动脱水机、EG1140H包埋机、RM2025切片机 （中国上海莱卡 2 仪器设备有限公司）；YT-6生物组织烤片机 （湖北孝感亚光医用电 子技术研究所）；101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱 （上海跃进医疗器械 厂）；Galanz WP800SL23微波炉 （广东顺德格兰仕电器厂）； 微 量移液器（上海求精医疗仪器厂）；SuperPAP Pen（ZLI-9070，北 京中山生物技术有限公司）；Olympus BX50F-3双目显微镜 （日本 奥林巴斯公司）。 1.3实验动物及分组 SD大鼠， 清洁级， 体重 （190±20）g，雌 雄各半，分笼饲养，共72只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司 提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，合格证号：0035887。将 大鼠适应性喂养3 d后，按性别、体重随机抽取12只作为正常对照 组，其余60只造成脾阳虚泄泻模型后，按性别、体重随机分为脾阳 虚模型组、脾阳虚高剂量治疗组 （高剂量治疗组）、脾阳虚中剂量治 疗组 （中剂量治疗组）、脾阳虚低剂量治疗组 （低剂量治疗组）、脾 阳虚自愈组，每组12只。 1.4造模方法 采用苦寒泻下加饥饱失常法，复制脾阳虚泄泻动物模 型。将SD大鼠适应性喂养3 d后，灌喂番泻叶100 %水煎剂1 ml／ 100 g大鼠体重。同时隔日喂饲，喂饲日饲料量不限。造模天数为15 d。 1.5给药方法 造模结束后第2 d， 将脾阳虚泄泻大鼠随机分组，治 疗组用苓桂术甘汤灌胃，高、中、低剂量治疗组分别为12 ml／kg、 10 ml／kg、6ml／kg，每日1次，连续15 d。脾阳虚自愈组不予 任何治疗，令其自然恢复。 1.6观察方法 观察大鼠外观、精神状态及食量、饮水量、体重、粪 便，每日测量大鼠体重、进食量、饮水量。实验结束后 （其中脾阳虚 3 模型于造模结束后），禁食12，颈椎脱臼处死h ，迅速剖腹， 取近 端小肠、近端升结肠各约1.0cm肠组织，放入4 %多聚甲醛中保存， 以备病理切片及免疫组化检测AQP4。免疫组化检测AQP4的表达： 采用SABC法，按说明书步骤进行操作。阴性对照：PBS代替一抗。 结果判定： 染色指数＝染色强度积分×染色面积比 染色强度积分， 按显色强弱记录为： 阴性0分，弱阳性1分， 阳性2分，强阳性3分。染色面积比根据腺体中染色细胞数占总体细 胞数的百分比。 1.7统计学处理 计量资料用x ±s表示， 采用SPSS 11.0版统计软 件包进行处理。2组间均数比较采用t检验， 多组间均数比较采用 单因素方差分析。 2结果