H1、H3亚型猪流感病毒核酸疫苗构建及鉴定.pdfVIP

病毒病一猪流感 H1、H3亚型猪流感病毒核酸疫苗构建及鉴定 谭磊1’2张丹1·2鲁会军1 田明尧1·2田宇飞1·2金扩世1’2金宁一1’2 (1．军事医学科学院军事兽医研究所长春130062；2．吉林大学畜牧兽医学院长春130062) 因片段克隆至真核表达载体pVAxlcMv启动子下游。通过脂质体法转染HeLa细胞，进行RT．PcR与间接免疫荧 表明重组质粒在转染HeLa细胞后出现了目的基因的转录，IFA证实目的基因在HeLa细胞上可有效表达，该研究为 抗H3、H1亚型流感病毒双价核酸疫苗的研究奠定了基础。 关键词 流感；真核表达；HeLa细胞：血凝素 流行性感冒足由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。自1933年以来，人类就开始了对流感 病毒的研究和流感疫苗的开发。但迄今为止，流感的流行依然挥之不尽。每年全球受A和B型流感 病毒影响的人达到5亿，在美国每年约有4万人死于流感，10万人受之影响而住院。川 疫苗的使用是预防流感的有效手段，临床上丰要应用灭活疫苗。但火活疫苗本身存在着种种不 足，随着分子生物学技术的飞速发展，学者们不断进行着新型基冈工程流感疫苗的探索。DNA疫 苗自m现以来就广泛应用于流感的研究，流感DNA疫苗已经成为DNA疫苗研究的苇要模型。其中 鼠，鸡，雪貂，猪等实验中，采用肌肉注射、鼻内滴注、基因枪等方式免疫HADNA疫苗后，实验 动物均获得良好的免疫保护。HA可裂解为HAl和HA2两部分，HAl足与宿主细胞膜表面受体结合 的部位，起着诱导机体产牛保护性抗体的作用，研究显示免疫HAlDNA疫苗与免疫HADNA疫苗 在诱导血清抗体上并没有显著差异lzJ。 目前猪流感呈现以H1、H3亚型和H5型流感病毒为辛，其它多种亚犁并存的流行趋势。A型流 感中的H1和H3亚型，危害尤为严重，曾造成过灾难件的“两班牙流感”和“香港大流感”，具有造成 大流行的潜在叮能。目前，虽然流感灭活疫苗早已采用i价的方式，基冈工程疫苗研究却往往只针 对单一的流感哑型，难以有效应对多亚犁并存流行的局面。本研究拟构建流感双价(Hl／H3)DNA疫 HA与Hl 苗，即采用真核表达载体pVAXl构建共表达H3 细胞中检测其表达，拓展了开发流感多亚型DNA疫苗的新思路，并为今后基因工程疫苗的开发奠 定基础。 1材料与方法 1．1毒种、载体及菌种 H1哑型流感毒株由长春生物制品所提供，毒株为A／New HA全阅读框质粒，由本室保存。H3哑型流感病毒HA基因令阅读框质粒参考 保存。克隆载体pMDl8．T购自大连宝生物公司。 1．2主要试剂 Ex DNA聚合酶、T4 Taq DNA连接酶、AMV逆转爿之酶及各种限制性内切酶，及核酸电泳分子 Reagem购于 术有限公司；兔抗流感Hl亚型HA抗体和H3亚型HA抗体购自昆山杰恩生物技术有限公司。 1．3引物设计与合成 设计并合成了_-：对流感HA基凶特异引物对已有含HlHA和H3HA基凶质粒进行改造。 420 第四次猪病学术研讨会会议论文集 下 游 引 物 P2： HlHAl Y1 上 游 引 物 ： 3’ 进行鉴定。 1．4 PCR产物回收、纯化及克隆载体的构建 试剂盒回收PCR产物，连接pMDl8．T载体上，转化至大肠杆菌DH5q，挑取单菌落，过夜培养， 提取质粒，酶切鉴定，含目的基因的重组质粒命名为pMDl8．T—H3HA与pMDl8．T．HlHAl。 1．5表达蛋白空间构像模拟 pVAXl．H3HA．H1HAl表达蛋白窄间构象进行了模拟。 1．6真核表达质粒的构建 0【中，挑取单菌落，过夜培养，提取质粒，酶切分析，获得重组 pVAXl连接，转化拿大肠杆菌DH5 双酶切的pVAXl一H3HA连接，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取单菌落，过夜培养，提取质粒，酶切 分析，获得重组质粒命名为pVAxl—H3